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目的探索不同长度poly(A)尾对mRNA体外表达的影响以及含poly(A)尾转录模板在大肠埃希菌中的传代稳定性。方法设计并构建含38、60、103、125 nt和60 nt+6 nt间隔序列+60 nt(简称126 nt)poly(A)尾的模板质粒, 利用单酶切将其线性化并以此作为转录模板进行体外转录反应制备增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)-mRNA。将含有不同长度poly(A)尾的EGFP-mRNA转染293T细胞, 流式细胞术检测EGFP表达情况。将poly(A)尾长度为125 nt和126 nt的模板质粒分别转化至大肠埃希菌TransStbl3感受态细胞以及Top10感受态细胞中, 各挑取7个单克隆进行培养并提取质粒, 质粒经双酶切后进行毛细管电泳检测。分别从中选取3个测序正确的单克隆于37℃条件下进行连续传代, 每两代提取一次质粒, 双酶切后进行毛细管电泳检测。同时将poly(A)尾长度为125 nt的两组单克隆再分别于30℃条件下进行连续传代, 每两代提取一次质粒并进行双酶切鉴定和毛细管电泳检测。结果成功构... 相似文献
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