聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒的制备及介导体外转染关节软骨细胞

背景：壳聚糖对软骨细胞具有良好的生物相容性和可降解性,但存在基因转染效率偏低的缺陷。 目的：构建负载增强型绿色荧光蛋白基因的聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒,检测其理化性能,以及体外对关节软骨细胞的基因转染效率。 方法：将聚乙烯亚胺共价连接于壳聚糖骨架上构建聚乙烯亚胺-壳聚糖复合物,再将聚乙烯亚胺-壳聚糖与负载增强型绿色荧光蛋白基因的质粒DNA以复凝聚法制成纳米粒,以扫描电镜检测纳米粒形态,Zeta电位粒度分析仪测定其粒径、表面电位;凝胶电泳阻滞实验观察聚乙烯亚胺-壳聚糖和质粒DNA的结合力。以聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒、裸质粒DNA、脂质体2000及壳聚糖/DNA纳米粒转染体外培养的兔关节软骨细胞,流式细胞仪及荧光显微镜检测基因转染率;激光共聚焦显微镜检测DNA的入核情况。 结果与结论：聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒多呈球形,粒径为(154.6±18.6) nm,表面Zeta电位为(24.68± 6.82) mV,可有效保护质粒DNA免受 DNaseⅠ的降解。体外转染实验证明聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒能介导增强型绿色荧光蛋白基因转染关节软骨细胞并在细胞内表达绿色荧光蛋白,转染率达(23.80±1.74)%,转染率高于裸质粒DNA组及壳聚糖/DNA纳米粒组(P < 0.05),与脂质体2000组无显著差别(P=0.522)。表明聚乙烯亚胺-壳聚糖/DNA纳米粒能有效保护质粒DNA免受核酸酶降解,对关节软骨细胞有良好的基因转染能力。     

曲霉菌内切型壳聚糖酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

背景：壳聚糖酶是高效、特异降解壳聚糖的酶,因此高效稳定地表达具有较高活性的壳聚糖酶可有效提高壳聚糖介导的基因治疗效果。目的：构建一种可高效降解壳聚糖的壳聚糖酶基因,探讨其在大肠杆菌中的表达及影响其活性的主要因素。方法：根据GenBank公布的曲霉菌CJ22-326内切型壳聚糖酶基因序列信息（EU302818）,设计并合成23条重叠引物,PCR 法扩增壳聚糖酶基因片段,构建原核表达质粒 pET28a-His6-CSN,将其转化大肠杆菌,收集融合蛋白His6-CSN,检测融合蛋白的表达及酶活性,同时检测不同pH值及温度对壳聚糖酶活性的影响。结果与结论：Western-blot证实融合蛋白His6-CSN成功表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示表达的融合蛋白相对分子质量约为29000,二硝基水杨酸比色法测定壳聚糖酶对壳聚糖的降解活性显著高于溶菌酶（P 〈0.05）,但低于灰色链霉菌壳聚糖酶（P 〈0.05）。壳聚糖酶的最适pH值和最适温度分别为6.0和50℃,当pH值在4.0-7.0、温度在30-50℃范围内具有较高的酶活性。