五灵胶囊调节TGF-β／Smad信号通路蛋白对胶原I、Ⅲ型表达的影响

目的探讨五灵胶囊（WL）调节肝纤维化大鼠肝组织及星状细胞（HSC）TGF-β／Smads信号转导蛋白对胶原I和Ⅲ型（COL～I、COL-Ⅲ）表达的影响。方法SD大鼠以高脂低蛋白饲养、饮用10％乙醇,皮下注射40％CCl4,隔4天注射1次,连续6周制备肝纤维化模型,灌胃给予WL3．86g／kg和秋水仙碱0．1mg／kg治疗1月;另体外分离HSC,以不同剂量的WL与HSC培养24h,最后3h加入TGF-β1 10ng／ml。实验结束后镜检肝细胞变性和肝组织纤维化程度,同时ELISA法测定血清COL-I、COL-Ⅲ和培养液COL—I含量,RT-PCR检测肝组织COL-I、COL-Ⅲ、TGF-β1 mRNA的表达。Western blot检测肝组织及HSC内COL—I、ProCOL—I、LN、α—SMA、ERK、p-ERK、TβRI、TβRⅡ、Smad2／3、Smad7蛋白表达。结果WL组大鼠肝细胞变性和肝纤维化程度明显减轻,血清COL-I、CoL-Ⅲ含量增加,COL-I、COL-ⅢmRNA表达降低。Western blot结果显示,WL能明显下调肝组织α—SMA、LN、p-ERK、TβRI、COL—I、ProCOL-I蛋白表达,对ERK、TβRⅡ、Smad2／3、Smad7蛋白表达无影响;显著下调HSCα—SMA、TβRII、p-ERK、Smad7表达,呈浓度依赖性抑制HSC分泌COL-I。结论WL抑制肝纤维化大鼠肝组织COL-I、COL-Ⅲ合成并增加COL—I降解,其作用位点是下调肝组织和HSCTGF-β／Smad、Ras／ERK信号通路蛋白p—ERK、TβRⅡ表达。     

柴胡及五灵丸对慢性肝损伤小鼠的影响

目的 观察柴胡与五灵丸对慢性肝损伤的作用，方法 采用四氯化碳（CCl4）、D－氨基半乳糖（D－GlaN）和脂多糖（LPS）与卡介苗（BCG）多次注射造成3种慢性肝损伤模型，给予同剂量的柴胡及五灵丸，测定血清转氨酶（ALT、AST）、胆碱酯酶（CHE），匀浆ALT与CHE、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、碱性磷酸酶（ALP）、一氧化氮（NO）、白介素2（IL－2）、白介素6（IL－6），HE染色观察肝组织形态学。结果 柴胡与五灵丸能有效地降低CCl4所致慢性肝损伤小鼠血清与匀浆ALT，升高血清CHE，降低GSH与MDA，但无降瘀胆作用，五灵丸降瘀胆显（P＜0.01），HE显示受损的肝细胞有较好的恢复作用，对D－GlaN升高的血清ALT有显抑制作用，升高CHE，降低MDA，但不降GSH，HE显示五灵丸修复损伤的肝组织不如柴胡，两药对免疫性肝损伤升高的ALT，AST有显降低作用（P＜0.01），使IL－2升高，柴胡抑制IL－6与NO，五灵丸显升高IL－6与NO。结论 两药对三种慢性肝损伤模型有不同程度的作用，对CCl4所致慢性肝损伤五灵丸优于柴胡，对D－GlaN所致慢性肝损伤柴胡优于五灵丸。     

五灵胶囊对脂多糖诱导枯否细胞内核转录因子-κB表达的作用

目的:通过体内、体外实验探讨五灵胶囊(WL)对免疫性肝脏炎症反应的作用机制。方法:制备卡介苗(BCG)+免疫佐剂+脂多糖(LPS)诱导小鼠免疫性肝损伤模型,WL灌胃给药12d,处死小鼠分离血清并制备肝组织蛋白;予大鼠WL 10、6.25g/kg灌胃4d,腹主动脉取血并制备含药血清;另取SD大鼠分离原代肝细胞和原代枯否细胞(KCs);采用Transwell小室下层培养KCs,含药血清-KCs条件培养上清对小室上层肝细胞作用。酶法测定免疫性肝损伤小鼠血清AST、ALT及条件培养上清中AST、ALT和LDH-L活性。取KCs培养成单层并同步化24h,PDTC和WL分别干预KCs 24h,再加入60μg/L的LPS诱导12h,Real-time PCR检测LPS诱导KCs表达MCP-1、IL-1、TNF-αmRNA水平,Western Blot检测免疫性肝损伤肝组织中和体外培养KCs表达TNFRⅠ、NF-κBs亚蛋白及IκKβ、IκB。结果:WL明显降低免疫性肝损伤小鼠血清ALT、AST活性并抑制肝组织内活化NF-κB信号通路;含药血清Ⅰ、Ⅱ组明显抑制活化KCs分泌促炎因子损伤肝细胞,WL抑制LPS诱导KCs表达NF-κBs信号通路蛋白,下调MCP-1、IL-1、TNF-αmRNA表达。结论:WL治疗慢性肝病炎症反应的作用机制与下调活化NF-κBs信号通路蛋白,阻滞KCs释放过量促炎因子所致肝细胞损伤相关。     

五灵胶囊中柴胡皂苷d在小鼠体内药代动力学研究

目的:探讨五灵胶囊中柴胡皂苷d在小鼠体内药代动力学特征.方法:小鼠ig五灵胶囊,在不同时间点采集血浆,加硫酸胺与乙腈-甲醇(4:1)混合液萃取制备样品液,经RP-HPLC测定血浆中柴胡皂苷d的浓度,SIP7软件拟合药动学参数.结果:小鼠ig给药五灵胶囊(5.5g/kg),五灵胶囊中柴胡皂苷d的药代动力学模型为一级吸收单室模型,其药代动力学参数在第1吸收峰Ka=2.341/h,Ke=0.081/h,Tmax=1.45h,Cmax=83.81ug/ml,T1/2Ke=7.76h;在第2吸收峰Ka=1.321/h,Ke=0.081/h,Tmax=6.48h,Ti/2Ke=7.76 h.结论:五灵胶囊中柴胡皂苷d在小鼠体内生物药剂学特征是吸收慢,清除也慢.     

胎儿期生长受限对雌性大鼠胰岛素抵抗及生殖的影响

目的 探讨胎儿生长受限以及成年后发生胰岛素抵抗,对雌性大鼠卵巢结构、功能和糖代谢的影响.方法 结扎孕鼠子宫动脉构建胎儿生长受限(FGR)模型.实验对象分为手术组(14只),对照组(8只).FGR和对照组新生雌鼠,各取30只,分为两组,给予正常饮食.①检测FGR和对照组大鼠空腹血糖(FPG)及胰岛素水平(FINS)、葡萄糖耐量及葡萄糖钳夹实验,计算稳态葡萄糖输注率(GIR).评价大鼠胰岛β细胞分泌功能及外周组织胰岛素敏感性;②观测FGR大鼠及对照组大鼠动情周期变化及睾酮(T)水平;③评估两组大鼠卵巢组织形态,采用Westem blot及免疫组化检测卵巢糖原合成蛋白激酶3(GSK-3β)含量和表达.结果 ①FGR大鼠成年后空腹血糖及胰岛素分别为5.60±0.82mmol/L和59.06±14.00mU/L,显著高于对照组的4.55±0.57mmol/L和47.20±15mU/L,t值分别为-3.353和2.203,均P<0.05).实验组血糖钳夹实验的GIR(7.95±0.8)mg·kg-1·min-1,低于对照组的(12.99±0.35)mg·kg-1·min-1,P<0.05;②与对照组相比FGR大鼠动情周期显著延长,睾酮的水平升高,FGR组大鼠动情周期(8.3±1.5)天长于对照组(5.1±0.9天);③两组大鼠卵巢内均见各级卵泡和黄体存在,两组大鼠卵巢形态学及重量未见明显差异,FGR大鼠卵巢GSK-3β表达显著升高,磷酸化糖原合成蛋白激酶(p-GSK-3β)表达下降.结论 ①FGR雌性大鼠存在成年期胰岛素抵抗;②雌性FGR大鼠可出现动情周期延长,稀发排卵;睾酮、胰岛素水平升高,卵巢局部糖代谢异常等类似多囊卵巢综合征表现.     

大鼠肝纤维化形成过程中TGF-β1/ERK信号通路与Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原表达变化

目的 观察大鼠肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)形成过程中TGF-β1/ERK信号通路蛋白与Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白表达的变化.方法 SD大鼠采用CCl4复合因素制备HF模型,分别于第2、3.5、4.5、5、6、10周时,取肝组织采用Masson染色检测肝细胞变性及胶原纤维增生程度;定量RT-PCR检测COL-Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、TGF-β1、PDGF-BB mRNA表达,Western blot法检测肝组织中COL-Ⅰ与TGF-β1/ERK信号传导通路蛋白表达的变化.结果 肝细胞脂肪性变与胶原形成程度随着造模时间的延长逐渐加重;COL-Ⅰ、Ⅲ mRNA与蛋白表达以2周、3.5周时显著上调,4.5周后降低,10周又显著上调,COL-Ⅳ表达水平在2～4.5周明显增加,随后下降至正常水平,p-ERK表达水平在各时相点增加与α-SMA表达水平有良好的一致性,p-ERK表达水平与TβRⅠ、TβRⅡ、PDGFRβ表达无良好一致性.结论 在HF形成过成中肝组织内p-ERK可激活肝星状细胞表达α-SMA,加强COL-Ⅰ、Ⅲ mRNA转录.     

椒目油A2对不同时相哮喘小鼠肺组织NF-кB信号通路及炎症因子表达的影响

目的：探讨椒目油A2（ZSOA2）对不同时相哮喘小鼠肺组织核因子- кB（NF-кB）信号通路和炎症细胞因子的影响。方法：采用腹腔注射 20% Al(OH)3+10%卵蛋白 (OVA) 混合液致敏并每天1次呼吸道滴入50 μL（0.4% OVA磷酸缓冲液pH =7.4）制备小鼠哮喘模型。在滴入后24 h、48 h、3 d、7 d、14 d分别处死小鼠,ELISA法测定肺灌洗液（BALF）中白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-5（IL-5）、干扰素-γ (IFN-γ) 含量;HE染色法检测肺组织病理形态学及伊红染色计数炎性细胞分类;Western blotting法测定肺组织NF-кB信号通路蛋白表达。结果：ZSOA2组能显著减少哮喘小鼠各时点肺组织嗜酸性粒细胞（EOS）、淋巴细胞 (LY)（P<0.05）;降低各时点BALF中IL-5、IL-4,升高IFN-γ的水平;下调肺组织中细胞黏附分子-1（ICAM-1）、血管内皮黏附分子-1（VCAM-1）、核因子抑制蛋白-α激酶（IKK-α）、磷酸化核因子抑制蛋白（p-IкB）的表达,上调肿瘤坏死因子受体1 (TNF-R1) 和磷酸化核因子- кB65（p-NF-кB65）蛋白表达水平。结论：ZSOA2治疗OVA诱发小鼠哮喘是下调肺组织内NF-кB信号通路中IKK-α和p-IкB表达,抑制细胞因子和趋化因子的释放与产生,使炎性细胞浸润程度减弱,而产生治疗哮喘的作用。     

肝卵圆细胞对肝纤维化大鼠肝组织TGF-β/Smad信号通路的影响

目的:探讨肝卵圆细胞(HOCs)对肝纤维化(HF)大鼠肝组织TGF-β/Smad信号通路蛋白表达的影响。方法:采用CCl4和复方因素制备HF大鼠模型,取模型组大鼠分离纯化HOCs,从门静脉植入HF大鼠肝组织内,连续观察30d,同时以五灵胶囊为阳性对照。在植入后8d、15d、23d、30d各组大鼠尾静脉采血,酶法测定血清天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT),实验结束取肝组织Masson染色观察肝组织形态学变化,Western blotting检测肝组织Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(ERK)、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(p-ERK)、转化生长因子β受体Ⅰ(TβRI)、转化生长因子β受体Ⅱ(TβRⅡ)、果蝇MAD类似基因2/3(Smad2/3)、果蝇MAD类似基因7(Smad7)蛋白的表达。结果:HOCs植入组与五灵胶囊组在植入后15d、23d、30dAST、ALT水平显著降低;肝组织胶原纤维增生程度明显减轻;肝组织表达ERK、p-ERK、TβRI、TβRⅡ蛋白作用显著降低,表达Smad7的作用显著增加。结论:植入HOCs可阻止大鼠HF的进展,其作用机制可能与其抑制肝组织内TGF-β/Smad信号通路p-ERK、TβRⅠ、TβRⅡ蛋白的表达有关。     

五灵胶囊对脂多糖诱导肝细胞因子所致肝损伤的作用机制

目的观察五灵胶囊对脂多糖(LPS)诱导肝脏内细胞因子所致肝损伤的调节作用。方法取昆明小鼠和BALB/c小鼠尾静脉注射LPS3.5mg·kg^-1,诱导细胞因子所致肝损伤模型,酶法测定ALT,AST,ALP;¹²⁵I放免法测定血清与肝匀浆IL-6,IL-8,TNF-α水平;免疫组化法染色并用Miaspro图象分析系统测定TNF-α,CD14,iNOS,eNOS阳性细胞率,同时体外培养枯否细胞,用HE染色观察细胞形态与免疫组化法定位及分析TNF-α,CD14,iNOS,eNOS表达。结果五灵胶囊2g·kg^-1组可使ALT活性降低(P<0.01),五灵胶囊2.0g·kg^-1和1.0g·kg^-1组均有降低AST活性(P<0.01);五灵胶囊两组血清与肝匀浆中IL-6,IL-8,TNF-α含量均低于模型组(P<0.01)。免疫组化结果显示,五灵胶囊3剂量组TNF-α,CD14细胞阳性表达率在肝组织损伤区低于模型组(P<0.05)。五灵胶囊组2剂量组iNOS阳性率高于模型组(P<0.01)。五灵胶囊组KC细胞扒片TNF-α,CD14表达强度降低,iNOS,eNOS表达强度相似模型组。结论五灵胶囊抑制各种诱因导致肝实质与非实质细胞释放大量细胞因子是治疗肝损伤机制之一,iNOS,eNOS增加可能是其活血化瘀的作用机制。     

五灵胶囊调节TGF-β/Smad信号通路蛋白对胶原Ⅰ、Ⅲ型表达的影响

目的探讨五灵胶囊(WL)调节肝纤维化大鼠肝组织及星状细胞(HSC)TGF-β/Smads信号转导蛋白对胶原Ⅰ和Ⅲ型(COL-Ⅰ、COL-Ⅲ)表达的影响.方法SD大鼠以高脂低蛋白饲养、饮用10%乙醇,皮下注射40%CCl4,隔4天注射1次,连续6周制备肝纤维化模型,灌胃给予WL 3.86 g/kg和秋水仙碱0.1 mg/kg治疗1月;另体外分离HSC,以不同剂量的WL与HSC培养24 h, 最后3 h加入TGF-β1 10 ng/ml.实验结束后镜检肝细胞变性和肝组织纤维化程度,同时ELISA法测定血清COL-Ⅰ、COL-Ⅲ和培养液COL-Ⅰ含量,RT-PCR检测肝组织COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1 mRNA的表达. Western blot检测肝组织及HSC内COL-Ⅰ、ProCOL-Ⅰ、LN、α-SMA、ERK、p-ERK、TβRⅠ、TβRⅡ、Smad2/3、Smad7蛋白表达.结果WL组大鼠肝细胞变性和肝纤维化程度明显减轻,血清COL-Ⅰ、COL-Ⅲ含量增加, COL-Ⅰ、COL-Ⅲ mRNA表达降低.Western blot结果显示,WL能明显下调肝组织α-SMA、LN、p-ERK、TβRⅠ、COL-Ⅰ、ProCOL-Ⅰ蛋白表达,对ERK、TβRⅡ、Smad2/3、Smad7蛋白表达无影响;显著下调HSC α-SMA 、TβRⅡ、p-ERK、Smad7表达,呈浓度依赖性抑制HSC分泌COL-Ⅰ.结论WL抑制肝纤维化大鼠肝组织COL-Ⅰ、COL-Ⅲ合成并增加COL-Ⅰ降解,其作用位点是下调肝组织和HSC TGF-β/Smad、Ras/ERK信号通路蛋白p-ERK、TβRⅡ表达.