人高密度脂蛋白受体基因3'UTR对其mRNA稳定性的影响

目的考察人高密度脂蛋白受体SR—BI基因3＇UTR对其mRNA稳定性的影响。方法以人肝癌细胞株HepG2基因组DNA为模板,PCR扩增获得SR．BI基因mRNA3＇UTR全长序列,克隆至荧光素酶报告基因的下游,分别构建重组质粒pc．1uc．3’UTR以及pGL3-CLAp—luc-3’UTR。利用脂质体转染HepG2细胞,进而检测转染后细胞的荧光素酶活性、荧光素酶报告基因mRNA的表达水平以及荧光素酶报告基因mRNA的半衰期。结果通过PCR成功扩增获得人SR—BI基因3’UTR全长序列,分别构建重组荧光素酶报告质粒pc-luc-3’UTR以及pGL3一CLAp—luc-3’UTR,并以pGL3一CLap-luc-3’UTR转染HepG2细胞建立稳定转染细胞株CLAp-luc．3’UTRHepG2。通过荧光素酶活性检测、实时荧光定量RT-PCR以及mRNA半衰期检测,结果证实SR．BI基因的3＇UTR的存在可显著降低荧光素酶活性及其mRNA水平,mRNA半衰期也显著缩短。结论SR—BI基因3＇UTR对其mRNA的稳定性有显著的影响,是SR．BI基因转录后水平调控的关键,为SR．BI基因表达调控提供了一个新机制。     

中国针灸学会第五次全国会员代表大会在京召开

中国针灸学会第五次全国会员代表大会于2011年8月19日—21日在北京召开,来自全国各地方学会、总会所属分支机构和各有关单位的代表、特邀代表、嘉宾共500余人出席了本次会议。卫生部副部长、国     

人抑瘤素M在大肠杆菌中的表达、纯化及其对胆固醇代谢关键基因表达的影响

目的构建人抑瘤素M(OSM)的原核表达载体,通过表达及纯化获得重组蛋白,为深入研究OSM的功能及机制奠定基础。方法利用PCR技术,从质粒pOTB7-h OSM中扩增出人OSM蛋白编码序列,与原核表达载体pET-16b连接,构建表达质粒pET16b-OSM。在BL21(DE3)工程菌中表达目的蛋白,Western blot法检测OSM蛋白的表达。为提高OSM的可溶性表达,采用共表达分子伴侣的方法提高其上清产物的表达量。将放大发酵的产物处理后,经镍亲和层析法纯化,获得OSM成熟蛋白,SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度。MTT法检测OSM对A375细胞的抑制活性,实时荧光定量PCR试验分析OSM对Hep G2细胞中胆固醇代谢相关基因(LDLR、ABCA1、Apo A-I和SR-BI)表达的影响。结果成功构建pET16b-OSM原核表达质粒,酶切鉴定和测序分析与预期结果完全一致。在E.coli BL21(DE3)中实现了目的蛋白的表达,通过共表达分子伴侣质粒pTf16,进一步提高了可溶性表达的水平。放大发酵产物经镍亲和层析纯化获得OSM成熟肽,电泳检测纯度大于98%。MTT法检测所制备的OSM蛋白抑制A375细胞生长的EC50为315ng/ml。mRNA水平检测证实OSM能剂量依赖地上调胆固醇代谢相关的低密度脂蛋白受体和ABCA1基因的表达。结论成功构建了OSM的原核表达载体,获得了具有生物学活性的目的蛋白,证实了其对胆固醇代谢关键基因转录的影响,为下一步功能及机制研究奠定基础。     

胞红蛋白表达纯化及抗氧化活性研究

研究人胞红蛋白(Cytoglobin,CYGB)的表达纯化、复性和抗氧化活性。人胞红蛋白基因工程菌pET28a/hC YGB/BL21(DE3)经IPTG诱导表达,包涵体分离,复性,透析和Sephacryl S-200层析分离,获得纯化的rhC YGB。SDS-PAGE和HPLC检测表明rhC YGB纯度达95%以上,紫外光谱分析证明rhC YGB分子含有血红素,圆二色谱分析表明该复性蛋白质具有正确的α-螺旋结构。生化分析及细胞水平试验表明rhC YGB具有过氧化物酶活性和抗氧化活性。小鼠急性乙醇肝损伤模型试验表明rhC YGB能有效保护乙醇所致的肝损伤。研究结果表明经添加血红素复性和纯化所得的rhC YGB具有正确的空间结构和抗氧化活性。     

中国针灸学会与上海绿谷(集团)有限公司合作协议签字仪式在京举行

2012年3月26日,中国针灸学会和上海绿谷(集团)有限公司在北京正式签署合作协议。双方将以建立"中国针灸学会科学技术奖"奖励合作机制、共同组织开展中医针灸方面的学术交流活动、共同开展中医针灸方面的合作项目,此次合作将进一步促进针灸学的传承和创新并积极推动针灸事业的发展与进步。中国针灸学会刘保延会长、绿谷集团吕松涛董事长共同签署了合作协议书并在签字仪式上发表讲话。     

胞红蛋白酵母表达载体构建与表达纯化

胞红蛋白是脊椎动物珠蛋白超家族的一员,具有重要的生物学功能,已在大肠杆菌中成功表达。酵母表达系统作为常用的真核表达系统,具有外源蛋白表达蛋白量大且活性高等优点。该研究通过PCR扩增技术获得胞红蛋白编码基因并通过DNA重组技术构建并鉴定了胞红蛋白毕赤酵母分泌型表达载体CYGB-pGAPZαA。将重组载体经单酶切线性化后通过电转化法转入毕赤酵母GS115,利用梯度浓度的Zeocin抗生素和PCR技术筛选得到阳性转化子。工程菌经发酵培养后,发酵上清液经镍柱分离得到较高纯度的目的蛋白,并经电泳等方法验证鉴定。     

心电向量图右心室肥厚与肺动脉压力的关系

为了探讨心电向量图右心室肥厚与肺动脉压力的关系,我们选择了高原健康人60例,肺气肿者25例,肺心病者45例,其它疾病患者(均排除左心疾病)20例,共148例。全部经过微导管(天津塑料研究所生产)检测静息平卧位状态下的肺动脉压,同时记录心电向量图。另选择100例海拔15米(杭州市)平原的20～50岁健康人的心电向量图(未做导管检查)作为无肺动脉高压对照组。心电向量图采用日本光电厂MVC-40A型仪器直接描     

心电向量图右心室肥厚与肺动脉压力的关系

为了探讨这一问题,我们选择高原健康人50例,肺气肺者25例,肺心病患者45例,其它疾病患者(均排除左心疾病)20例,共150例。全部经过微导管检查测定静息平卧位状态下的肺动脉压,并同时记录心电向量图。为了对照,我们选择海拔15米(杭州市)~#平原地区20～50岁100例健康人的心电向量图(未做导管检查,但依据一般的生理资料。可作为无肺动脉高压组。心电向量图仪均使用日本Fukudat和光电MVC—40A型两种仪器直接描记。     

胞红蛋白在CHO细胞中的表达及其抗氧化活性研究

构建胞红蛋白(Cytoglobin,CYGB)真核表达载体,并在CHO细胞中进行表达。通过PCR技术扩增了CYGB基因序列,并将CYGB基因序列定向插入pcDNA3.1(+)表达载体中,构建了pcDNA3.1-CYGB真核表达载体。将重组表达载体pcDNA3.1-CYGB转染CHO细胞,经G418筛选出阳性细胞株。培养、收集细胞,提取细胞总蛋白,经Western Bloting鉴定证明CYGB表达。通过H2O2(800μmol/L)诱导的氧化应激损伤实验,检验CYGB的抗氧化活性,与对照组相比,CYGB表达细胞株提高了细胞内超氧化物酶(SOD)的活力,显著的提高了细胞在H2O2诱导的氧化应激下的存活率。研究结果表明,真核表达载体pcDNA3.1-CYGB构建成功,CYGB在真核细胞CHO中成功表达。     

人载脂蛋白A-I表达上调剂的发现与活性研究

目的筛选上调人载脂蛋白A-I(ApoA-I)基因表达的新型活性化合物,并在表达和功能水平对其作用进行研究。方法利用人ApoA-I基因表达上调剂筛选模型对化合物库进行筛选;对发现的活性化合物在ApoA-I启动子水平进行量效关系研究;利用实时荧光定量RT-PCR检测ApoA-I mRNA的表达水平;利用Western blot、ELISA和流式细胞技术检测ApoA-I的蛋白表达;利用胆固醇流出试验检测ApoA-I介导的巨噬细胞胆固醇外流的情况。结果从20 000样次化合物筛选中得到活性化合物5238B-69,在一定浓度范围内存在转录调控活性的量-效关系,当化合物浓度为0.30μg/ml时,上调ApoA-I表达活性达到最高值(408%),EC50为0.01μg/ml。5238B-69能显著上调HepG2细胞中ApoA-I mRNA的水平;同时,Western blot结果显示5238B-69能增加HepG2细胞ApoA-I蛋白的表达。ELISA结果显示,与对照相比,5238B-69作用48 h时,胞外ApoA-I水平增加了48%,流式细胞检测表明,5238B-69作用24 h后,胞内ApoA-I蛋白水平增加了21.4%。功能分析试验显示,5238B-69作用HepG2细胞上调生成的ApoA-I,能促进巨噬细胞RAW264.7内[3H]标记的胆固醇的流出。结论得到一个具有上调ApoA-I表达的活性化合物,在提高ApoA-I表达水平和生物学功能方面均有明显的效果。