SUMO表达系统高效、可溶性表达重组鼠源IL-1β

目的:从LPS刺激过的小鼠胸腺细胞中克隆IL-1β基因,通过原核表达,获得具有生物活性的可溶性鼠源IL-1β蛋白,为深入研究和利用IL-1β基因奠定基础。方法:提取LPS刺激的小鼠胸腺细胞总RNA,反转录成cDNA,以此为模板,根据GenBank报道的mIL-1β序列设计引物,进行巢式PCR,得到成熟mIL-1β的编码序列基因,并插入到原核表达载体pHisSUMO ex-press中SUMO标签的下游,构建重组表达载体pHisSUMO express-mIL-1β。将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达mIL-1β/SUMO融合蛋白,Ni-NTA Agarose纯化后,表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,用SUMO protease-1切去SUMO标签,经纯化并切去融合标签后获得成熟mIL-1β蛋白。用MTT方法检测目的蛋白对L929细胞的生物学活性。结果:DNA测序证明所克隆基因序列与GenBank报道的完全一致,SDS-PAGE分析表明融合蛋白的相对分子质量为37kD,切割后的成熟蛋白为17kD,与理论值相符。且蛋白表达量高,主要以可溶形式存在。Western blot证实该蛋白为mIL-1β。成熟蛋白纯化产物纯度超过95%以上,通过MTT的方法检测证明其具有使L929细胞增殖的作用,从而说明其具有生物学活性。结论:利用大肠杆菌表达系统可高效可溶性表达高纯度的具有生物活性的mIL-1β蛋白。     

一株中和人IL-17免疫活性的单克隆抗体的制备

目的制备抗人IL-17单克隆抗体,并鉴定其中和活性。方法用hIL-17作为免疫和检测抗原,用间接ELISA法筛选分泌抗人IL-17抗体的杂交瘤细胞株,并对抗体进行中和活性鉴定。结果获得1株稳定分泌抗人IL-17单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型重链为IgG2b,轻链为κ;该株杂交瘤细胞腹水效价为1∶8.192×105;传30代及液氮中保存6个月,抗体效价稳定;Western Blot检测证明该单抗与人IL-17蛋白特异地结合;单抗亲和常数为8.192×10-9 mol/L;ELISA及Real-time-PCR检测证明该单抗能够有效地阻断人IL-17刺激Hela细胞产生IL-6的作用。结论所制备的抗人IL-17单克隆抗体具有高度的特异性、稳定性及中和活性,为针对IL-17为靶点的抗体药物的开发奠定了基础。     

具有中和活性的抗人IL-1β单链抗体的构建

目的构建抗人IL-1β单链抗体(anti-hIL-1βscFv)的原核表达载体,并对其表达的蛋白进行生物学活性检测。方法使用PCR的方法从含有抗人IL-1β抗体基因的质粒中获得抗人IL-1β的单链抗体基因,将其插入原核表达载体pET-27b中,构建重组表达载体pET-27b-hIL-1βscFv。将该载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)后诱导表达,经凝胶过滤色谱柱上复性得到可溶的抗人IL-1β的scFv蛋白。使用ELISA方法鉴定scFv抗体的特异性结合活性,使用Real time-PCR的方法检测scFv抗体的中和活性。结果成功地对抗人IL-1β单链抗体进行诱导、表达和复性,蛋白相对分子质量约为28 000。ELISA结果证实scFv蛋白对hIL-1β具有特异性结合能力。Real time-PCR实验结果证实该scFv抗体可以有效阻断人IL-1β刺激人T细胞表达细胞因子IL-18及IL-1β的作用。结论通过原核表达系统得到的抗人IL-1β单链抗体经复性后,与人IL-1β蛋白有特异性结合能力,并且表现出中和活性,为进一步研究人IL-1β相关疾病及其治疗性抗体奠定了基础。     

SUMO融合系统表达人白细胞介素17及其活性的研究

目的:克隆、表达和纯化人白细胞介素17(hIL-17),并对其生物学活性进行研究。方法:采用RT-PCR的方法从活化的人T细胞中克隆获得hIL-17cDNA。构建了含羟胺切割位点的重组载体pHisSUMO-hIL-17,导入宿主菌Rosetta中,经IPTG诱导后得到表达。用Ni-NTA琼脂糖颗粒层析纯化融合蛋白,经羟胺切割,复性,通过Western blot实验进行确认,并从核酸水平和蛋白水平鉴定其活性。结果:克隆表达出了hIL-17,利用Ni-NTA琼脂糖颗粒层析纯化得到的纯品蛋白经体外活性实验表明,该蛋白具有刺激3T3-L1细胞和HeLa细胞分泌IL-6、IL-8、G-CSF的作用。结论:制备了具有生物学活性的成熟hIL-17蛋白,为进一步研究该分子在疾病中的作用奠定了基础。