MRSA耐药相关TG-TPase嵌合基因的原核表达与纯化

目的 设计、构建耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant Staphylococcus aureus,MRSA)耐药相关TGTPase嵌合基因,进行原核表达、纯化探索,为进一步利用其酶学活性建立抑制剂筛选系统奠定基础.方法 通过引物设计,从盐平板法筛选的MRSA菌株中分别克隆PBP2的TG基因片段和PBP2a的TP片段,分别克隆入T载体,对阳性重组子进行酶切/再连接,构建TG-TPase嵌合基因,经核苷酸测序鉴定正确的嵌合基因再亚克隆到pET22b,构建表达载体,转化Rosetta(DE3)plysS,用LPTG进行诱导表达,并对表达的蛋白进行SDS-PAGE、质谱和Westem blotting鉴定.小量发酵重组菌,对嵌合基因表达产物进行初步纯化.结果 从13株临床分离的金葡菌中筛选出2株高耐药性MRSA菌株,用PCR法从中成功地克隆到青霉素结合蛋白PBP2的TG片段和PBP2a的TP片段,构建了TG-TPase嵌合基因及其原核表达载体,并在大肠埃希菌中表达,产量达菌体总蛋白的43%.融合蛋白纯化分析表明,嵌合蛋白以包涵体形式存在,在变性条件下经Ni-NTA亲和柱纯化,纯度达90%以上.结论 成功设计并构建了耐药性金葡菌TG-TPase嵌合基因及其重组表达工程菌,为进一步利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选奠定基础.     

金葡菌TG-TPase嵌合基因在甲醇营养型酵母中的表达

目的 设计耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)耐药相关TG-Tpase嵌合基因,构建其真核表达质粒,为嵌合基因的高效、分泌型表达奠定基础.方法 在序列结构分析的基础上,设计引物从MRSA菌株中扩增其耐药性相关转糖基酶(Tgase)和转肽酶(Tpase)活性片段,进一步用酶切连接等分子生物学操作构建TG-Tpase嵌合基因,亚克隆至酵母表达质粒pPIC9K中,转化DH5a大肠埃希菌.经酶切、PCR和核苷酸测序鉴定正确的重组质粒用Sal I线性化,整合入甲醇营养型毕赤酵母GS115中,在DNA和基因转录水平鉴定出阳性重组酵母.结果 采用PCR从MRSA基因组中扩增得到了873 bp的Tgase片段和1 044 bp的Tpase片段.以酶切连接构建的TG-Tpase嵌合基因经酶切、PCR鉴定,能获得约1 900 bp的融合片段,与预期结果 相符,测序表明序列和阅读框均正确.线性化的重组质粒转化GS115后,得到5个高拷贝阳性转化子,经诱导表达和PCR鉴定,这些转化子能转录出目的基因的mRNA.结论 成功构建了含TG-Tpase嵌合基因的重组毕赤酵母工程菌,为进一步高效制备嵌合蛋白、进而利用其酶学活性进行抗耐药性金葡菌抑制剂的筛选创造前提.     

大鼠静脉输液装置的设计和制作

目的：介绍一种自行设计的鼠用静脉输液装置。方法：将静脉留置管、活动套管及转轴连在一起,制成一小巧、灵活的输液装置。结果：大鼠在输液时可自由活动,留置管无脱落、扭曲,置管７ｄ无不良反应。结论：该装置设计合理、制作简单、价格低廉,适用范围广。