结核分枝杆菌MPT64双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

目的 建立结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白MPT64的双抗体夹心ELISA检测方法并评价初步应用效果。方法 采用间接ELISA和ELISA叠加试验在各株抗MPT64 mAb中筛选出亲和力较高的识别不同抗原表位的配对抗体;Protein A亲和层析纯化配对的2株mAb腹水,其中1株mAb偶联生物素(Biotin)作为检测抗体,另1株作为捕获抗体,棋盘滴定法优化捕获抗体和检测抗体的工作浓度,建立双抗体夹心ELISA方法;以常规条件作为初始反应条件,依次优化包被、封闭、抗原、抗体以及底物反应环节的条件;以MPT64抗原检测评估建立的ELISA方法的检测限、线性范围、精确性、准确性和特异性;采用该方法检测Mtb H37Ra不同阶段培养上清中MPT64含量,初步评价应用效果。结果 ELISA法成功筛选出配对抗体H2F4和A5B2 mAb;液相色谱法从腹水中纯化获得的mAb滴度分别为1∶102 400、1∶51 200。以生物素偶联的A5B2 mAb作为检测抗体,以H2F4 mAb为捕获抗体,建立并优化MPT64双抗体夹心ELISA方法,确定的试...     

结核分枝杆菌EsxV亚单位疫苗黏膜免疫诱导的免疫应答

目的 研究结核分枝杆菌抗原Rv3619c(EsxV)黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答水平。方法 PCR法扩增esxV基因克隆入原核表达载体pET28a(+),获得的重组E.coli诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定蛋白的表达,亲和层析法纯化EsxV蛋白。以EsxV和/或联合环二腺苷酸(c-di-AMP)经鼻黏膜免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测小鼠特异性抗体水平及亚类,MTS法检测脾细胞增殖,qRT-PCR检测脾和肺脏细胞因子表达水平,ELISA法检测脾细胞因子分泌水平。结果 成功构建EsxV的原核表达载体pET28a(+)-esxV并诱导表达目的蛋白,亲和层析法获得了纯化的重组EsxV蛋白。EsxV经黏膜免疫可诱导显著的体液免疫应答,但诱导的细胞免疫应答水平不高。EsxV与c-di-AMP经黏膜接种可诱导特异性IgG水平增加,EsxV蛋白特异的脾细胞增殖,脾和肺细胞的IFN-γ转录增加。c-di-AMP显著提高EsxV特异的IFN-γ、IL-2、IL-10和IL-17细胞因子分泌,而不诱导炎症因子TNF-α和IL-6表达。结论 EsxV与c-di-AMP佐剂构建的亚单位疫苗可诱导特异性体液和细胞免疫应答,可进一步用于新型结核病亚单位疫苗的研制。     

用异硫氰酸荧光素标记葡萄球菌A蛋白检测抗核抗体

旨在建立一种血清抗核抗体检测的新方法.首先以异硫氰酸荧光素标记葡萄球菌A蛋白,将冰冻于燥的葡葡球菌A蛋白溶解于缓冲液中,4℃磁力搅拌下逐滴加入异硫氰酸荧光素,并持续搅拌24h,然后SepheadexG25柱层析一次.得到异硫氰酸荧光素标记葡萄球菌A蛋白试剂.实验同荧光素标记抗     

肾轻链沉积病和轻链型淀粉样变的电镜及免疫电镜研究

目的：探讨电镜及免疫电镜方法在肾轻链沉积病(light chain deposition disease，LCDD)和轻链型淀粉样变(amyloid，AL)诊断中的作用。方法：对我院1994年1月至2002年2月间的肾活检病例进行电镜观察，对疑为LCDD及早期AL的病例进行轻链(κ、λ)的免疫电镜标记。结果：6例符合LCDD的诊断，36例符合AL的诊断。LCDD电镜下可见肾小管基底膜外侧、肾小球基底膜内侧、鲍曼囊外侧及小血管壁的点状、颗粒状电子致密物质沉积，其中2例早期病例表现颗粒状物质节段性分布；免疫电镜标记，颗粒状物质被单种轻链标记，其中K轻链4例，λ轻链2例。AL电镜下可见肾小球系膜区、毛细血管壁及小动脉壁的纤维物质分布，其中15例早期病例表现系膜区或／及毛细血管壁的纤维结构呈节段性分布；15例早期AL的免疫电镜标记结果，纤维结构被单种轻链标记，其中κ轻链4例，λ轻链11例。结论：肾脏LCDD及早期AL的诊断需依赖于电镜检查，免疫电镜检查对早期LCDD及早期AL的确诊具有不可替代的作用。     

抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原(Ag85B-ESAT-6)亚单位疫苗黏膜免疫对结核分枝杆菌的免疫应答

目的 评价抗原85B-6kDa早期分泌靶抗原融合蛋白(AE)亚单位疫苗经黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答及其对结核分枝杆菌(MTB)感染的保护力。方法 分别用AE、 AE联合环二腺苷酸(c-di-AMP)亚单位疫苗经鼻黏膜免疫小鼠,ELISA检测抗体水平以及1型辅助T(Th1)细胞的细胞因子γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素2(IL-2)和Th2细胞的IL-10分泌水平,实时荧光定量PCR检测IFN-γ、 IL-2、 IL-10和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的mRNA水平。MTB静脉感染免疫小鼠,ELISA检测感染小鼠血清抗体及脾细胞细胞因子分泌水平,HE染色分析肺病理改变,平板法计数菌落形成单位(CFU)检测脾和肺荷菌数。结果 AE和AE联合c-di-AMP经鼻黏膜免疫可诱导小鼠产生高水平的特异性抗体,促进脾细胞增殖、脾和肺脏Th1/Th2型细胞因子和TNF-α转录增加、脾Th1/Th2型细胞因子分泌增加。小鼠MTB感染后,与对照组相比,AE和AE联合c-di-AMP免疫小鼠特异性抗体水平仍升高,Th1/Th2型细胞免疫应答增强,肺组织呈炎症反应,肺、脾荷菌数显著降低,且AE联合c-di-...     

乳腺癌患者放疗的心理分析与护理干预

目的讨论乳腺癌患者接受放射治疗的心理状态,及时针对性护理干预对治疗和预后的重要意义.方法就诊时或入院时沟通心理调查,住院治疗期间心理追踪调查和出院随访调查.结果本组接受放疗患者存在心理障碍较多,经针对性护理干预,较好地支持临床治疗.结论对接受放射治疗的乳腺癌患者应进行心理调查,及时介入针对性护理干预,使其顺利完成全程治疗回归社会.     

实验性增生性甲状腺肿及淋巴细胞性甲状腺炎的病理研究

本文采用52只SD纯种雄性大白鼠,以低浓度甲基硫氧嘧啶(MTU)水溶液代饮用水,进行增生性甲状腺肿(HG)及淋巴细胞性甲状腺炎(LT)的实验性研究。动物自10天开始即有甲状腺滤泡细胞增生及功能活跃细胞出现。1～2个月出现类似人类HG的变化。3～4个月表现HG与LT并存的过渡阶段。5～6个月出现类似人类LT的变化。从实验发展过程中可观察到HG在连续用MTU—个阶段后可发展成LT。说明HG和LT两病为同一病因的两个不同发展阶段,均有免疫反应性变化存在。本文对HG和LT时垂体促甲状腺素(TSH)细胞的演变及疾病的发病机理进行了分析讨论。     

腹膜小细胞恶性肿瘤光镜、免疫组化及超微结构观察

获取稳定表达重组人血小板生成素（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ, ＴＰＯ）的ＮＩＨ３Ｔ３成纤维细胞克隆,为开展成纤维细胞介导的 ＴＰＯ基因治疗研究提供细胞学基础。方法：以重组人ＴＰＯ ｃＤＮＡ为目的基因,构建真核细胞表达重组体ｐｃＤＮＡ３／ＴＰＯ,藉脂质体将其转染于ＮＩＨ３Ｔ３细胞,经Ｇ４１８筛选,获得稳定表达重组人ＴＰＯ的细胞克隆,应用ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ及 Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹等技术鉴定目的基因的导入及表达。 结果：ｐｃＤＮＡ３／ＴＰＯ可藉脂质体转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞,转染细胞可稳定表达并分泌ＴＰＯ。结论：已获得所需细胞克隆,为应用人ＴＰＯｃＤＮＡ进行基因治疗奠定了基础。     

结核分枝杆菌6 kD早期分泌靶抗原单克隆抗体的制备及其特异性分析

目的 制备结核分枝杆菌(Mtb)6 kD早期分泌靶抗原(ESAT-6)单克隆抗体(mAb)并分析其特异性。方法 用亲和层析法纯化目的蛋白ESAT-6,并用该蛋白免疫小鼠。分离免疫小鼠的脾细胞并与骨髓瘤细胞融合,筛选分泌mAb的杂交瘤细胞系。制备腹水并纯化mAb。酶联免疫吸附试验法分析mAb亚类和相对亲和力,蛋白印迹法检测其特异性。结果 制备了可分泌ESAT-6抗体的杂交瘤细胞系,获得了纯化的mAb。mAb亚型为IgG1,相对亲和力为3.9×10^-5。该mAb可特异性识别Mtb的ESAT-6。结论 制备抗ESAT-6的mAb为ESAT-6用于结核病诊断与防治制剂及其机制研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64单克隆抗体的制备及其特异性

目的 制备结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)分泌蛋白MPT64的单克隆抗体(Monoclonal antibody,mAb),并分析mAb的特异性。方法 PCR扩增mpt64基因并克隆入pET28a(+)构建原核表达载体;将获得的重组菌株在IPTG作用下诱导表达MPT64蛋白,Western blot验证蛋白表达;亲和层析法纯化目的蛋白。重组MPT64蛋白免疫小鼠,取脾细胞与杂交瘤细胞SP2/0融合,筛选得到阳性杂交瘤细胞系。以该杂交瘤细胞制备小鼠腹水,中压液相色谱仪纯化腹水获得mAb。ELISA法检测获得的mAb的相对亲和力和亚类,Western blot检测mAb的特异性。结果 本研究成功构建原核表达载体pET28a(+)-mpt64并诱导表达了MPT64蛋白。亲和层析法获得纯化的重组MPT64蛋白。该重组蛋白免疫小鼠的脾细胞和SP2/0细胞融合后,经筛选获得能够稳定分泌抗MPT64 mAb的杂交瘤细胞系MPT64-A5B2。中压液相色谱仪纯化小鼠腹水中的MPT64-A5B2 mAb。该mAb的亲和力为2.813×10^-7 g/mL,属于IgG 1亚类。MPT64-A5B2 mAb能特异性识别Mtb中的MPT64蛋白。结论 本研究制备了MPT64重组蛋白,并获得了抗MPT64 mAb,为MPT64用于结核病诊断和治疗制剂的研制奠定了基础。