猪水疱病重组蛋白P1的豚鼠免疫试验

目的：研究重组猪水疱病病毒（SVDV）P1蛋白的免疫活性。方法：将自制的猪水疱病抗原经佐剂乳化免疫豚鼠，并应用T淋巴细胞增殖试验、阻断ELISA及微量细胞中和试验检测了所制备的免疫原免疫豚鼠后在体液免疫和细胞免疫方面进行了全面的评价。结果：前期制备的抗原免疫豚鼠后具有良好的免疫原性。结论：对该亚单位疫苗可做进一步的开发应用。     

猪FMDV受体整联蛋白β1亚基LBD多克隆抗体的制备和初步应用

目的表达口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β1亚基配体结合域β1LBD,制备兔抗β1LBD多克隆抗体检测β1p-CHOK1细胞β1亚基的表达。方法利用PCR方法扩增整联蛋白β1LBD基因片段,经BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切后与pGEX-4T-1原核表达载体相连,构建的pGEX-β1LBD重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并提取包涵体,纯化目的蛋白。然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA和Western blot方法分别鉴定抗体的效价和特异性,并用制备的抗体以间接免疫荧光抗体法对β1p-CHOK1细胞中β1亚基的表达进行检测。结果SDS-PAGE电泳分析显示阳性菌经诱导后表达一Mr约为42000的GST-β1LBD融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带,用纯化GST-β1LBD免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12800以上,具有较高的特异性,间接免疫荧光显示β1p-CHOK1细胞β1亚基表达于其细胞表面。结论制备了具有高亲和性和特异性的兔抗猪源整联蛋白β1LBD多克隆抗体,为深入研究猪源整联蛋白β1在口蹄疫病毒感染过程中的作用了奠定基础。     

秦川黄牛成熟朊蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备及鉴定抗秦川黄牛成熟朊蛋白的单抗。方法用重组成熟朊蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,以间接ELISA方法筛选能够稳定分泌抗成熟朊蛋白的单抗的杂交瘤细胞株。以亲和层析法纯化腹水抗体,检测其Ig类和亚类、效价、相对亲和力以及特异性,并用基因片段表达作图法初步分析抗原表位。结果获得了能够稳定分泌抗牛成熟朊蛋白的杂交瘤细胞株N64,分泌的抗体属于IgG2a,腹水效价为1×105,相对亲和力为0.15μg/ml,Western blot表明该单抗具有较强的特异性。表位分析显示N64单抗仅与羧基端重组朊蛋白反应。结论抗牛成熟朊蛋白的腹水单抗N64效价高、亲和力和特异性强,可以作为疯牛病免疫诊断的核心试剂。     

稳定表达猪瘟病毒E2蛋白细胞系的建立及其生物活性分析

目的:建立一种能稳定表达猪瘟E2蛋白的真核细胞系,并对E2蛋白的生物活性进行分析.方法:从实验感染兔脾组织中提取总RNA,应用RT-PCR得到了CSFV C-株结构蛋白基因E2,并在目的片段的5′端引入Kozak序列(Kozak,1987),定向克隆于逆转录病毒载体pBABE puro.经PCR、酶切和序列分析鉴定,获得阳性重组质粒.将该重组质粒与水疱性口炎病毒载体pVSV-G共转染GP2-293细胞,收获假型病毒,在Polybrene的介导下感染PK15细胞,嘌呤霉素筛选阳性细胞克隆.通过细胞传代并结合PCR、免疫荧光及ELISA方法对表达蛋白的生物活性进行分析.结果:初步检测显示所建立的PK15-E2细胞能稳定携带外源基因进行传代,而且表达的E2蛋白能被CSF阳性血清所识别,并具有良好的生物活性.结论:通过该方法建立的真核表达系统是切实可行的,能为猪瘟的预防和诊断奠定良好的基础.     

口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域多克隆抗体的制备和特性分析

目的:表达口蹄疫病毒受体猪源整联蛋白β6亚基配体结合域β6LBD, 并制备兔抗β6LBD多克隆抗体.方法:利用PCR方法扩增整联蛋白β6LBD基因片段, 经BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切后连入pGEX-4T-1原核表达载体, 构建的 pGEX-4T-1-β6LBD重组表达质粒, 转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株, 经IPTG诱导表达, SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达并提取包涵体, 纯化目的蛋白.然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体, 以ELISA方法测定抗体效价, 并以Western blot鉴定其特异性.结果:SDS-PAGE电泳分析显示pGEX-4T-1-β6LBD诱导后表达一Mr约为42 000的GST-β6LBD融合蛋白, 与预期结果相符.目的蛋白纯化后, 在电泳图片上显示较为清晰的单一条带, 用纯化GST-β6LBD免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12 800以上, 具有较高的特异性.结论:制备了具有高亲和性和特异性的抗猪源整联蛋白β6LBD多克隆抗体, 为深入研究整联蛋白β6在口蹄疫病毒感染过程中的作用了奠定基础.     

口蹄疫病毒O/China/99株多基因植物组成型表达载体的构建及序列分析

目的构建包含FMDV结构蛋白P1、非结构蛋白2A、3C以及部分2B的基因片段P12X3C的植物组成型表达载体。为FMDV可饲疫苗的研制奠定基础。方法通过PCR扩增法，从pGEM／P12A质粒和pGEM／3C质粒中扩增P12A及部分2B基因（P12X）、3C基因，将获得的P12X与3C片段经Bam HI／SpeⅠ和SpeⅠ／SalⅠ双酶切后，与经Bam HI／SalⅠ双酶切后的pUC18质粒大片段连接，得到重组质粒pUC18／P12X3C，pUC18／P12X3C质粒经Bam HI／SalⅠ双酶切后的大片段与经同样双酶切的植物表达载体pBin438连接。转化子经酶切、PCR及测序鉴定后。获得包含FMDVO／China／99株P12X3C片段的植物组成型表达载体pBin438／P12x3C，最后通过三亲交配法，将表达载体pBin438／P12x3C导入农杆菌。结论成功构建FMDV多基因的植物组成型表达载体。     

口蹄疫病毒P1+3CD基因重组腺病毒的构建

目的构建包含有O型口蹄疫病毒(FMDV)强毒结构蛋白(P1)基因及弱毒非结构蛋白(3CD)基因的重组腺病毒,为进一步研制FMD活载体疫苗奠定基础。方法通过RT-PCR方法扩增得到含有FMDV P1、3CD编码区的目的基因。P1基因经BglⅡ和XhoⅠ,3CD基因经XhoⅠ和XbaⅠ双酶切后与经BglⅡ和XbaⅠ双酶切处理的腺病毒穿梭载体pAd Track-CMV连接。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体在大肠杆菌内同源重组获得重组腺病毒质粒。线性化后的重组腺病毒质粒转染293细胞,通过观测细胞病变及报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒。结果在pAd Track-CMV载体中成功克隆了P1+3CD基因,并与腺病毒骨架载体在大肠杆菌中实现了同源重组。线性化后的重组腺病毒质粒转染293细胞后可观测到典型的细胞病变与绿色荧光蛋白的表达。结论成功获得了含有FMD P1+3CD基因的重组腺病毒,为FMD活载体疫苗的研制提供了依据。     

SAT2型口蹄疫病毒南非地区分离株结构蛋白VP1及其C端的表达、纯化和反应原性分析

目的:表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP1及其C端,进行反应原性分析并制备多克隆抗体。方法:以SAT2型口蹄疫病毒南非地区分离株结构蛋白VP1编码区的重组克隆载体为模板,设计特异性引物,扩增VP1基因及其C端编码区,然后将该其分别克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)plysS,经IPTG诱导,以金属离子螯合层析法对表达的VP1、VP1C端融合蛋白进行纯化,经Westernblot对其反应原性进行分析。用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA方法测定抗体效价。结果:实现了SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP1及其C端的高效表达,表达产物主要以包涵体的形式存在。SDS-PAGE显示纯化的目的蛋白分别在相对分子质量35000和19000处有单一目的条带,具有较高的纯度。Westernblot结果显示,纯化的VP1及其C端均可与牛SAT2型FMDV阳性血清反应,而与阴性对照血清无交叉反应。结论:用纯化的VP1及VP1C融合蛋白免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12800以上,具有较高的特异性。     

牛口蹄疫病毒受体通用亚基αv配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备

目的:利用原核细胞表达牛口蹄疫病毒受体通用亚基整联蛋白αv的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体。方法:以含有牛整联蛋白全长cDNA的质粒为模板PCR扩增得到位于αv成熟肽氨基端的LBD基因片段,经酶切消化处理后,与同样酶切处理的原核表达载体pPRoEXTMHTb相连,构建原核表达质粒pPRo/αvLBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达αvLBD蛋白。通过SDS-PAGE鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。通过ELISA和Western blot鉴定血清效价和特异性。结果:成功构建了pPRo/αvLBD原核表达载体,实现了重组αvLBD蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其Mr约为40000,主要以包涵体形式存在于菌体中。制备的兔多克隆抗体效价达1∶25600以上。以Western blot检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性。结论:实现了牛口蹄疫病毒受体通用亚基αvLBD的高效表达和高效价多克隆抗体的制备,为深入研究整联蛋白αv在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础。     

病毒感染与逃避免疫反应的研究进展

病毒和宿主共生过程中,病毒为了生存繁衍形成多种逃避宿主免疫反应的方式。其中病毒抗原变异逃逸抗体的中和和病毒干扰补体激活的关键环节来抑制宿主的抗病毒状态是病毒拮抗机体体液免疫反应的主要途径。此外,病毒还利用编码多种细胞因子的类似物干扰细胞因子的正常功能,造成有利于病毒生存复制的内环境,从而使得病毒能够持续感染机体。