Spacer区蛋白对ADAMTS13活性影响的研究

目的:本研究旨在获得血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13中重组的spacer区蛋白,进一步探讨该区域对ADAMTS13功能发挥的作用。方法:以ADAMTS13全长质粒为模板,构建含spacer区基因序列的原核表达质粒,转染大肠杆菌,低温(30℃)IPTG诱导表达,收集超声上清并鉴定。并大规模诱导表达,利用Ni-NTA琼脂糖柱,梯度咪唑淋洗法纯化蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot法鉴定纯化产品纯度和免疫学活性。利用重组蛋白与免疫性调节的血栓性血小板减少性紫癜(iTTP)患者血浆孵育,检测血浆中ADAMTS13的活性变化。结果:成功构建能表达spacer区的原核表达质粒并能有效表达蛋白。Western blotting结果显示,抗6×His抗体和抗人ADAMTS13抗体(针对Gln34-Trp688)分别能与重组蛋白在15 kDa处显单一条带。功能实验表明,该重组蛋白能够有效逆转iTTP患者中被自身抗体抑制的ADAMTS13酶活性。结论:重组蛋白具有较好的免疫原活性和纯度,为进一步研究spacer区对iTTP的发病机理提供了实验依据。     

阻断血管性血友病因子与胶原结合的抗人vWF-A3单抗的鉴定和功能研究

目的 制备阻断血管性血友病因子(von Willebrand因子)A3区(vWF-A3)与胶原结合的抗vWF-A3单抗,并对其进行生化鉴定和功能研究.方法 用重组vWF-A3蛋白免疫BALB/c小鼠,经标准的方法制备单抗.用ELISA法鉴定单抗特异性,经vWF胶原结合抑制试验筛选获得抑制性单抗,用免疫印迹技术确定单抗与重组(r)vWF-A3和还原性人vWF识别的抗原分子.经胶原结合试验确定单抗对vWF与胶原结合的影响.结果 获得一组共30株抗vWF-A3单抗,其中两株确定为抑制vWF与胶原结合的单抗,分别命名为SZ-123和SZ-125,两株单抗分别与rvWF-A3和vWF强反应,而不与rvWF-A1、A2反应.免疫印迹分析显示SZ-123和SZ-125分别识别相对分子质量为27×103的rvWF-A3、250×103还原性人vWF单体和170×103的vWF酶切片段.单抗SZ-123和SZ-125不仅剂量依赖性地抑制纯化的人血浆vWF与人胎盘和牛皮肤Ⅲ型胶原结合,而且分别抑制人、猕猴或Beagle犬血浆vWF与人胎盘和牛皮肤Ⅲ型胶原结合.结论 抗vWF-A3单抗SZ-123和SZ-125是两株抑制性单抗,有望成为具有治疗潜力的抗血栓药物.     

人血小板膜糖蛋白GPIbα（H1-V289）的原核表达及其生物活性研究

目的获得重组的血小板膜糖蛋白GPIbα的N端片段（1-289氨基酸）,进一步研究其在血栓与止血过程中的生物功能。方法利用质粒pCMV3（编码GPIbαH1-V289）设计引物,构建pQE30-GPIbα（H1-V289）表达载体,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达蛋白。用Ni-NTA琼脂糖层析柱不同pH值梯度淋洗法纯化蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定纯化产品纯度和免疫学活性,并观察重组蛋白对瑞斯托霉素和ADP诱导血小板聚集的影响。结果成功获得纯度较高的重组GPIbα（H1-V289）蛋白,浓度为0.6 mg/ml。Western blot检测结果显示,抗GPIbα单抗SZ2能在34 kd区域显示条带。而且纯品能有效抑制瑞斯托霉素诱导的血小板聚集,对ADP诱导的反应无抑制作用。结论重组蛋白具有较好的免疫原性和生物活性,并可以大量获得,为开发抗血栓药物奠定了基础。     

Annexin Ⅱ siRNA对淋巴瘤Jurkat细胞凋亡的影响

目的观察沉默膜联蛋白Ⅱ（annexinⅡ,A2）基因对淋巴瘤Jurkat细胞凋亡的影响。方法采用A2 siRNA转染人淋巴瘤Jurkat细胞后应用RT-PCR和Western blot鉴定干扰效果。Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测其对细胞凋亡的影响。结果Real-time PCR和Western blot检测结果表明,A2基因被成功抑制。流式细胞术检测得A2siRNA组细胞凋亡率为57.47%±2.10%,较阴性对照组（28.68%±1.21%）明显增加,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论A2基因可增强Jurkat细胞抗凋亡作用,A2 siRNA可诱导Jurkat细胞凋亡。     

硼替佐米对内皮细胞株HMEC-1VEGF基因表达的影响及其机制探讨

本研究探讨硼替佐米对内皮细胞株HMEC-1VEGF基因表达的影响,并检测低氧诱导因子-1α（HIF—1α）转录调节活性和膜联蛋白A2（AnnexinA2）表达强度的变化以分析VEGF基因表达变化可能的机制。用细胞计数试剂盒CCK-8检测细胞的相对增殖活力;采用实时定量PCR检测VEGF基因表达强度,RT-PCR检测碳酸酐酶Ⅸ（CAIX）的基因表达强度,用实时定量PCR和Western blot分别检测AnnexinA2在基因和蛋白水平的变化。结果表明：2．5、5．0、10nmol／L硼替佐米作用12小时,内皮细胞株HMEC．1VEGF基因表达强度分别为：0．730±0．106、0．673±0．153、0．767±0．090（0nmoWL时为1．0）（P〈0．05）;2．5、5．0nmol／L药物未明显抑制细胞的增殖活力（P〉0．05）,10nmol／L时细胞增殖则明显被抑制（p=0．024）,不同浓度硼替佐米处理后,CAIX基因表达强度均明显降低,HIF—1α转录调节活性受到抑制;AnnexinA2蛋白的表达也明显受抑。结论：低剂量的硼替佐米对蛋白酶体活性无明显抑制作用;硼替佐米可能通过调节内皮细胞H1F-1α的活性和AnnexinA2蛋白的表达下调VEGF基因的表达水平。     

Mer免疫球蛋白样区原核蛋白表达和单克隆抗体制备

目的利用原核蛋白表达载体,体外表达Mer的IgG样区,并利用此重组蛋白制备抗Mer的单克隆抗体。方法从K562细胞中抽提总RNA,利用RT-PCR扩增Mer的IgG样区片断。经过测序将所得片断与PQE30原核表达载体连接并转化到大肠杆菌M15中,挑选阳性克隆,经诱导和纯化后获得原核蛋白。利用所得的重组蛋白免疫Balb/c小鼠,取其脾脏和小鼠杂交瘤细胞融合制备针对Mer的IgG样区的特异性抗体。利用ELISA方法筛选阳性克隆,Westernblot方法进行验证。结果体外成功表达MerIgG样区的原核蛋白,片断大小经修饰后约为26kd,表达量占菌体总蛋白的15%,经Ni-NTAagrose柱纯化后得到纯化蛋白并免疫Balb/c小鼠。将小鼠脾脏细胞和杂交瘤细胞融合后得到1株特异性抗MerIgG样区的单克隆抗体——SZ-128,Westernblot显示此单抗可以和表达的重组蛋白和Mer胞外区真核蛋白反应。结论成功制备1株抗MerIgG样区的特异性单克隆抗体,为研究Mer的功能提供了有力的工具。     

大鼠抗小鼠重组膜联蛋白A2单克隆抗体的制备与鉴定

目的建立能够分泌特异性抗小鼠膜联蛋白A2（AnxA2）的大鼠-小鼠融合单克隆抗体杂交瘤细胞系。方法利用重组小鼠AnxA2蛋白作为抗原免疫Wistar大鼠,通过细胞融合和杂交瘤筛选技术建立特异分泌抗小鼠AnxA2蛋白的大鼠-小鼠融合单抗杂交瘤细胞株。采用酶联免疫吸附方法确定单克隆抗体亚型,免疫印迹和流式细胞术验证所筛选的单克隆抗体的特异性。结果通过对30多个分泌抗体的融合细胞克隆的筛选,获得一株分泌特异性抗小鼠AnxA2的大鼠-小鼠融合单克隆抗体杂交瘤细胞系SZ-158,连续培养传代后染色体分析证实,Wistar大鼠脾细胞与小鼠SP2/0细胞稳定融合;免疫印迹和流式细胞术显示该单克隆抗体可以特异识别小鼠AnxA2重组蛋白。结论该研究所获得的大鼠-小鼠融合单克隆抗体特异性针对小鼠AnxA2蛋白,可用于AnxA2转基因小鼠中AnxA2表达的检测,为深入研究AnxA2的功能提供了物质保障。     

硼替佐米对内皮细胞迁移及血管新生的影响

Objective To investigate the effects of bortezomib on the migration of endothelial cells and the expression of angiogenesis-related molecules,and explore the mechanism of its antiproliferation of tumor cells.Methods Cell count kit CCK-8 was used to detect the relative proliferation activity of cells after treated by bortezomib at different concentrations for 12 h and 24 h,respectively.Transwell model was uesd to detect the migration rate of cells.Expression levels of VEGF and Annexin A2 genes were determined by realtime quantitative PCR.Annexin A2 protein was validated by Western blot.Results After treated with bertezomib at concentrations of 2.5、5.0 and 10 nmol/L for 12h,respectively,the HMEC-1 cell proliferation activity was 1.004±0.002,0.793±0.021 and 0.874 4-0.062,respectively,being no statistical difference from that of control group(1.000)P<0.05);while the migration rates of them were 0.697±0.060,0.597±0.090 and 0.874±0.062,respectively,being significantly lower than that of control group(1.000)(P<0.05 ) and so did for the expression of VEGF and Annexin A2 genes.After treated with 5 nmol/L bortezomib for 12 h.the Annexin A2 and VEGF gene relative expression level of HMEC-1 cells was 0.540±0.001 and 0.793±0.153,respectively,being of statistical difference from that of control group(1.000)P<0.05).The conspicuous downregulation of Annexin A2 protein was also confirmed by Western Blot.Conclusions Bortezomib can inhibit migration of endothelial cell HMEC-1 by downregulating the expression of VEGF and Annexin A2, displaying a new mechanism of bortezomib for inhibition of tumor proliferation.     

硼替佐米对内皮细胞迁移及血管新生的影响

Objective To investigate the effects of bortezomib on the migration of endothelial cells and the expression of angiogenesis-related molecules,and explore the mechanism of its antiproliferation of tumor cells.Methods Cell count kit CCK-8 was used to detect the relative proliferation activity of cells after treated by bortezomib at different concentrations for 12 h and 24 h,respectively.Transwell model was uesd to detect the migration rate of cells.Expression levels of VEGF and Annexin A2 genes were determined by realtime quantitative PCR.Annexin A2 protein was validated by Western blot.Results After treated with bertezomib at concentrations of 2.5、5.0 and 10 nmol/L for 12h,respectively,the HMEC-1 cell proliferation activity was 1.004±0.002,0.793±0.021 and 0.874 4-0.062,respectively,being no statistical difference from that of control group(1.000)P<0.05);while the migration rates of them were 0.697±0.060,0.597±0.090 and 0.874±0.062,respectively,being significantly lower than that of control group(1.000)(P<0.05 ) and so did for the expression of VEGF and Annexin A2 genes.After treated with 5 nmol/L bortezomib for 12 h.the Annexin A2 and VEGF gene relative expression level of HMEC-1 cells was 0.540±0.001 and 0.793±0.153,respectively,being of statistical difference from that of control group(1.000)P<0.05).The conspicuous downregulation of Annexin A2 protein was also confirmed by Western Blot.Conclusions Bortezomib can inhibit migration of endothelial cell HMEC-1 by downregulating the expression of VEGF and Annexin A2, displaying a new mechanism of bortezomib for inhibition of tumor proliferation.