单纯疱疹病毒Ⅰ型在兔脑神经细胞中的形态与形态发生

研究单纯疱疹病毒Ⅰ(HSV-Ⅰ)在兔脑神经细胞(RNC)中的形态与形态发生。方法 用电子显微镜观察超薄切片,并拍照记录。结果RNC感染HSV-Ⅰ6h后,细胞核中即可见散在核衣壳,12h后细胞核和细胞质内均可见到,但以核内多见,24h后病毒量达高峰。胶质细胞内的核衣壳多于神经元,胶质细胞和神经元的细胞质内和胞外可见少量有包膜的完整病毒。病毒颗粒为圆形或椭圆形,核心直径38～54nm,核衣壳77～100hm,成熟病毒115～129nm。结论RNC对HSV-Ⅰ高度敏感,HSV-Ⅰ在兔脑神经元和胶质细胞中的形态发生有一定的差异。     

不同药物抗风疹病毒的实验研究

目的为筛选有效的抗RV药物。方法选用9种新合成的腺嘌呤衍生物、6种尿嘧啶衍生物及大黄醇提液,分别在BHK21、RNC和HNC细胞上进行了体外抗病毒试验。在BHK21上以CPE为观察指标,在RNC和HNC上因不出现明显的CPE,则将细胞培养物转种于BHK2l细胞并用间接免疫荧光和免疫酶技术检测药物的抗病毒效应。结果取代基为—CH2—C6H5、—(CH2)2OH、—C6H5—CH3的腺嘌呤衍生物及取代基为—CH3、—(CH2)2OH、—C6H5—CH3、—C6H5—Cl的尿嘧啶衍生物,对RVJR-23的最小抑毒剂量在78～625mg／L之间;大黄醇提液对RVJR-23的最小抑毒剂量为5000mg／L。结论上述药物均有抗RV作用,大黄醇提液的作用较新合成的部分腺嘌呤与尿嘧啶衍生物更为明显,且毒性小。     

发热伴血小板减少综合征病毒致细胞程序性死亡的研究

目的研究发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV)感染致细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)形式, 并进一步于蛋白水平探讨细胞焦亡的存在, 为研究SFTSV致病机制提供新的思路。方法用不同感染复数(multiplicity of infection, MOI)SFTSV感染Vero细胞, 逐日观察细胞病变效应(cytopathic effect, CPE), CCK-8法检测细胞活力、LDH释放试验检测细胞膜受损情况, 以判定病毒的最佳感染量与细胞死亡时间。使用不同PCD抑制剂分别对Vero细胞进行预处理后感染SFTSV, CCK-8法检测细胞活力, 判断SFTSV致PCD死亡形式。采用Western blot检测细胞焦亡相关蛋白的含量, 进一步探讨焦亡的存在。结果 SFTSV以MOI=10感染Vero细胞后48 h、72 h为后续实验最佳感染量与时间, 此时细胞CPE明显, 细胞活力降至对照组的51%、41%(P<0.001、P<0.001...     

风疹病毒JR_(23)株感染BALB/c小鼠脑组织的病理学特征

为研究风疹病毒（ＲＶ）ＪＲ２３株感染中枢神经系统（ＣＮＳ）的特性及病理学特征,ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠经腹腔感染ＲＶ ＪＲ２３株,并于感染后的第２１ｄ 取小鼠大脑及小脑组织,ＨＥ及免疫组织化学染色,观察小鼠脑组织ＲＶ 感染状况及病变特征。结果显示,受感染的小鼠无明显的ＣＮＳ症状,病理学特征以大脑灰质小灶性神经元变性坏死为主,病变神经元周围见增生的少突胶质细胞形成卫星现象。在神经元坏死灶中可见小胶质细胞增生,形成噬神经元现象及由小胶质细胞和少突胶质细胞构成的胶质细胞结节。神经元及神经胶质细胞内未见病毒包涵体。免疫组织化学染色显示,ＲＶ 主要分布于大脑灰质,神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞均可受到ＪＲ２３株的感染。提示卫星现象、噬神经元现象和胶质细胞结节形成可作为ＲＶ－ＪＲ２３感染ＣＮＳ的病理学参考指标。免疫组织化学染色对确诊ＣＮＳＲＶ 的感染具有特异性     

对临床实习的几点建议

临床实习是医学生医学教育的重要组成部分,是医学生将课堂学习到的理论知识与实践相结合的重要途径,是医学生向临床医师过渡的关键性实践阶段,临床实习效果的优劣直接影响到医学生的成长。医学生过渡为临床医师是一个发生质变的过程,而临床实习是促进这种质的转变过程发生的必要环节。尽管如此,目前医学生在临床实习过程中仍存在较多问题,诸如重视不够,管理不到位,学生基础理论知识、基本功不过关,临床实践技能培训不到位,偏科现象严重等等。本人临床带教多年,在此就临床带教过程中的相关问题提出自身的看法,供各方面参考。1强化管理,确保成…     

酵母表达的风疹病毒E1在ELISA检测中应用

目的将毕赤酵母表达系统中表达的E1糖蛋白作为包被抗原,建立一种优于病毒作为包被抗原的风疹病毒(rubellavirus,RV)抗体ELISA检测方法。方法将重组包膜糖蛋白(E1)抗原和风疹病毒分别作为包被抗原,用间接ELISA法检测90份临床血清标本,同时用晶美(JINGMEI)进口分装试剂盒和德国RECI公司试剂盒进行检测;将RECI试剂盒作为金标准,计算另外三者检测结果的特异性、灵敏性和符合率;比较他们之间的差异有无统计学意义,特别是重组抗原与病毒抗原作为包被抗原检出RV抗体阳性率的差异有无统计学意义。结果重组蛋白重复性实验结果经统计学处理,P>0·05,差异无统计学意义;RECI试剂盒与重组抗原、病毒抗原的检测结果差异有统计学意义(P<0·05);重组抗原与病毒抗原的检测结果差异有统计学意义(P<0·05),作为包被抗原,重组抗原优于病毒抗原。结论用毕赤酵母表达的RVE1重组蛋白作为包被抗原进行ELISA检测优于病毒作为包被抗原,具有广阔的应用前景。     

艾滋病痴呆综合症患者体内HIV-1 tat基因的克隆及原核表达

目的     探讨艾滋病痴呆综合症（AIDS dementia complex,ADC）患者体内外周和中枢不同组织部位的人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）反式激活因子（tat）第一外显子基因序列的变异并对其进行表达,用于研究HIV-1 Tat变异对其神经毒性的影响。方法     从ADC病例尸检标本的脾脏（spleen,SPL）、脑膜（meninges, MG）和基底核（basal ganglia,BG）3个部位的组织中提取基因组DNA,用PCR方法扩增出tat第一外显子基因,并将其插入到pGEM-T克隆载体中,测序证实为HIV-1 tat基因,BioEdit软件对测序结果进行比对。将克隆载体双酶切,回收目的基因,并将其连接到pGEX-KG表达载体中,将重组表达质粒pGEX-KG-tat转化BL21大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,表达产物用SDS PAGE和Western blot进行检验和鉴定。结果    成功克隆了HIV-1 tat第一外显子基因,序列比对发现外周和中枢部位的Tat氨基酸序列不同;构建了pGEX KG-tat重组表达载体,并在原核细胞中高效表达了谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合Tat蛋白,SDS PAGE和Western blot分析表明,所表达的蛋白为Tat蛋白。结论     ADC患者外周和中枢不同组织部位的HIV-1 tat第一外显子基因所编码的Tat蛋白氨基酸序列存在变异,在原核细胞中对其进行了高效表达,为Tat蛋白的神经毒性研究奠定了基础。     

人季节性H1N1流感病毒小鼠感染模型的建立

目的制备人季节性H1N1流感病毒的小鼠感染模型,为研究流感病毒致病性、研发抗病毒药物提供模型动物。方法将人季节性H1N1流感病毒在鸡胚尿囊腔扩增后,滴鼻接种小鼠,4 d后将小鼠处死,挑选感染体征严重者进行实时荧光PCR(FQ-PCR)检测肺中的流感病毒,将检测阳性的肺上清在鸡胚尿囊腔扩增,接种于下一代小鼠。比较各代小鼠对流感病毒的适应情况,直至小鼠出现明显的感染体征,取肺研磨制成匀浆,获得流感病毒鼠肺适应株并检测其半数致死量(LD50)。将10 LD50的病毒液接种于小鼠,建立人季节性H1N1流感病毒的小鼠感染模型,观察模型小鼠的一般活动状态、体质量变化、肺部病变,HE染色观察肺部病理切片,计算肺指数,FQ-PCR检测病毒RNA。结果人季节性流感病毒在小鼠体内传代4次后,鼠肺适应株制备完成,其经鼻的LD50为10-2.41/0.05 mL。人季节性流感病毒的小鼠感染模型,一般状态差,体质量明显减轻,肺指数增大,70%出现死亡。病理切片观察病变明显,FQ-PCR显示流感病毒阳性。结论成功建立了人季节性H1N1流感病毒的小鼠感染模型。     

肠道病毒71型山东临沂分离株全基因组序列分析

目的 自1例死亡患儿的标本中分离EV71,并分析其全基因组序列特点,研究其基因序列的改变是否与其神经毒力有关.方法 咽拭子标本采自山东临沂市人民医院1例死亡患儿,在人横纹肌瘤细胞(RD)上分离EV71,分段扩增获得EV71的全序列,用BLAST、Bioedit和MEGA 4进行序列分析.结果 获得1株EV71分离株SDLY107,基因组全长7405 bp,全基因组核苷酸序列与2008年的阜阳株Fuyang.Anhui.P.R.C/17.08/2同源性最高,为98.6%,与原型株BrCr/70的同源性为80.0%,与神经毒型株MS/87的同源性为86.5%.系统进化分析表明,SDLY107与中国大陆的北京株、河南株、广西株、深圳株、兰州株、阜阳株、重庆株、浙江株的亲缘关系较近,按照传统的VP1基因分型方法,可归为C4亚型,是近年来我国大陆流行的主要基因亚型.氨基酸序列分析发现,SDLY107与其他毒株相比,有2个特有的突变(E947D,K1873R).结论 SDLY107分离株属于C4亚型,氨基酸突变E947D和K1873R可能与EV71的致病性有关.

Abstract：

Objective To isolate enterovirus 71 from a death children,and analyze whether the neurovirulence was related to the variation of nucleotide and amino acid. Methods Enterovirus 71 was isolated from throat swabs which were colleted from Shandong Linyi People's Hospital. The full length genome was sequenced by amplification with RT-PCR and sequencing of 9 overlapped gene fragments covering full length of the genomes. The nucleotide and amino acid sequenced was aligned by BLAST, Bioedit and MEGA 4. Results A strain of enterovirus 71 was isolated and named as SDLY107. The full length was 7405 bp. The results of homology analysis of overall nucleotide sequence showed that strain Fuyang. Anhui. P. R. C/17.08/2 had highest homology (98.6%)with strain SDLY107, and the homology was 80.0% between strain SDLY107 with prototype strain BrCr/70,and 86. 5% between strain SDLY107 with nerve strain MS/87. Phylogenetic analysis showed that the phylogeny was close between SDLY107 with some isolated strains from Chinese Mainland, such as Beijing, Henan, Guangxi, Sbenzhen, Lanzhou, Fuyang, Chongqing and Zhejiang strains, which was clustered for C4 subtype. The results of amino acid sequence analysis showed that there were 2 mutations, E947D and K1873R, for strain SDLY107. Conclusion SDLY107 belonged to C4 subtype, amino acid mutations E947D and K1873R of which may be relevant to the pathogenicity of EV71.