应用二维电泳和质谱技术鉴定乳腺癌相关蛋白

目的 通过比较人乳腺癌细胞MCF7和乳腺上皮细胞MCF10A的差异表达蛋白,以发现可能用于早期诊断的乳腺癌肿瘤标志物.方法 体外培养人乳腺癌细胞MCF7和乳腺上皮细胞MCF10A,提取细胞总蛋白,进行二维凝胶电泳并比较分析,选择在乳腺癌细胞MCF7中明显差异表达的蛋白点,进行质谱和生物信息学分析.结果 建立了MCF7和MCF10A两种细胞系的二维凝胶电泳图谱,平均蛋白质点数分别为(960±44)和(1128±29);对选择的35个差异表达蛋白质点进行质谱和生物信息学分析,鉴定了其中16个点,包括过氧化氢酶-6(PRDX6)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK1)、60 kD热休克蛋白(CH60)、谷氨酰胺转移酶-2(TGM2)等.结论 乳腺癌细胞MCF7相对于乳腺上皮细胞MCF10A的差异表达蛋白可能作为乳腺癌早期诊断和预后评价的候选肿瘤标志物.     

LAPTM5过表达对LPS诱导小鼠B淋巴细胞WEHI231增殖与活化的影响

目的通过构建LAPTM5野生型和NZB型腺病毒,体外感染小鼠B淋巴细胞系WEHI231,探讨LAPTM5过表达对LPS诱导WEHI231增殖与活化的影响。方法采用qRT-PCR检测RAW264.7、WEHI231和NIH3T3三种细胞系中LAPTM5表达,采用LAPTM5野生型和NZB型腺病毒体外感染WEHI231细胞,采用LPS(1μg/ml)刺激WEHI231细胞,采用qRT-PCR检测细胞内LAPTM5 mRNA的表达变化,证实LAPTM5过表达效果,CCK-8法检测WEHI231细胞增殖能力的变化,采用qRT-PCR检测细胞内IL-6和TNFαmRNA的表达变化,初步探讨LAPTM5过表达对LPS诱导WEHI231细胞增殖与活化的影响。结果LAPTM5在小鼠巨噬细胞RAW264.7中高度表达,在小鼠B淋巴细胞WEHI231中较低表达,而在小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3中不表达。感染LAPTM5野生型和NZB型腺病毒的WEHI231细胞中,LAPTM5 mRNA的表达水平显著增加(P0.05)。LAPTM5过表达后,LPS诱导WEHI231增殖能力显著增加,LPS诱导细胞中IL-6和TNFαmRNA的表达水平显著增加(P0.05),而LAPTM5 NZB型腺病毒对细胞增殖与活化能力的影响与野生型相比并无差异(P0.05)。结论LAPTM5过表达可促进LPS诱导小鼠B淋巴细胞WEHI231增殖与活化。     

hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.     

反相高效液相色谱法测定人乳腺癌MCF7细胞中基因组DNA甲基化水平

目的 利用反相高效液相色谱法检测MCF7细胞系中基因组DNA的甲基化水平.方法 采用Nano LC(75 μm×15 cm,5 μm)和Micro LC(1.0 mm×15 cm,5 μm)的C18反相色谱柱,以甲醇-醋酸铵缓冲液(pH 5.0)为流动相,使用线性梯度程序,将MCF7细胞中基因组DNA水解产物进行分离,两种体系流速分别是300 nl/min和40μl/min,在273 nm波长处检测,利用外标法分别检测DNA中脱氧胞嘧啶(dC和甲基化脱氧胞嘧啶(5mdC)含量.结果 MCF7基因组DNA的水解产物,经反相色谱分离得到的峰图有较好的准确性与重复性;DNA水解后的产物为弱保留化合物,且Micro LC分离效果优于Nano LC;乳腺癌细胞MCF7甲基化水平为19.3%,高于正常细胞中基因组DNA甲基化水平.结论成功的将MCF7细胞中基因组DNA水解产物经反相色谱分离;使用Micro LC分离DNA水解后的弱保留产物较佳;MCF7细胞系基因组DNA甲基化水平高于正常细胞.     

流感病毒反向遗传技术合成rH5/PR8融合病毒的生物学活性

目的 探讨用流感病毒反向遗传技术合成的人工融合病毒株的生物学活性,对人工合成的融合流感病毒株进行全面、系统地研究,对其作为疫苗株的可行性、有效性提供科学依据,方法用流感病毒反向遗传技术合成rH5/PR8减毒病毒株,测定5代病毒与原代病毒HA基因序列,确认外来基因的遗传稳定性;用细胞实验确认其增殖性,用动物实验确认其致病性的强弱.结果 人工合成的rH5/PR8融合病毒株除HA外,均来自A/PR/8/34(PR8),HA来自H5N1型强致病性禽流感病毒,第1050碱基从G定点突变成C,导致344号氨基酸从精氨酸变为苏氨酸,并剪除第1054～1065碱基,致使第346～349的碱性氨基酸(RKKR)部位被去除.该病毒的增殖能力可以达到109 PFU/ml,外来基因HA5基因遗传稳定、不易变异,达到疫苗株的要求;鸡脑内即静脉接种活病毒实验证实病毒呈现弱毒性结论用流感病毒反向遗传技术合成的人工融合病毒株有良好的增殖性及基因遗传稳定性,用基因剪切技术对HA的碱性氨基酸连续序列的敲除可以减低病毒的致病性.对鸡呈现弱毒性.     

二维电泳和质谱技术筛选寻常型银屑病皮损差异表达蛋白

目的:明确寻常型银屑病(psoriasis vulgaris,PV)皮损组织与正常人皮肤中的差异表达蛋白。方法:收集PV皮损组织及正常人皮肤组织。提取蛋白,进行二维凝胶电泳,选择在PV皮损组织中明显差异表达的蛋白点,进行质谱和生物信息学分析。结果:PV患者角质层和真皮层二维凝胶电泳鉴别蛋白总数分别为(1961±21)和(1928±49)个,确定差异表达蛋白30个,其中14个被鉴定分型:包括角质1型细胞骨架(K1C10、K1C14、K1C15、K1C16)、角质2型细胞骨架(K2C1),肌动蛋白(ARP3,ACTA,ACTBM),热休克蛋白(PHB,HSPβ1,CH60),中心体蛋白(CP135),膜联蛋白(ANXA4、ANXA5)。结论:差异表达蛋白可能在PV的病理形成中起重要作用,是潜在的PV诊断标记物。     

1L-22RA1基因多态性与系统性红斑狼疮发病相关性的研究

 目的探讨白细胞介素22 受体A1（1L-22RA1 ）外显子基因多态性与中国北方汉族人群系统性红斑狼疮（SLE）及狼疮肾炎（LN）发病的相关性。方法利用基因测序、聚合酶链式反应鄄单链构象多态性（PCR鄄SSCP）电泳技术对中国北方汉族人群基因单核苷酸多态性（SNP）进行筛选,通过比较基因型在SLE 病例组与健康对照组中的分布,进而研究1L-22RA1与SLE/LN 的相关性。结果在1L-22RA1基因第7 外显子处存在1 个有义SNP 位点,该位点存在3 种基因型,即C/C 型、C/G 型和G/G 型。各型在SLE 病例组和健康对照组中的分布差异无统计学意义。结论1L-22RA1外显子基因有义SNP与中国北方汉族人群SLE 的易感性可能无相关性。     

不同恶性度膀胱癌细胞系的比较蛋白组学研究

目的 利用比较蛋白质组学双向电泳技术,观察不同恶性程度和侵袭力的人膀胱移行细胞癌细胞系T24和BIU-87蛋白表达谱的变化.方法 人膀胱癌细胞(BIU-87和T24)经培养后提取总蛋白.双向凝胶电泳,经考马斯亮蓝染色后比较两者蛋白图谱寻找差异表达蛋白质.采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和蛋白质数据库检索鉴定差异蛋白.结果 比较T24和BIU-87的蛋白质斑点发现差异大于2倍的蛋白质点153个,对其中94个差异蛋白斑点进行了质谱鉴定和肽质量指纹图分析.相对于BI-U-87,恶性度高的T24表达上调的蛋白质有Rho GDP-解离抑制因子1、组织蛋白酶D、细胞角化蛋白19、ACTG1蛋白、超氧化物歧化酶、热休克蛋白、ACTB蛋白和硫氧还蛋白4等;表达下调的蛋白有14-3-3 δ蛋白、orphan hormone nuclear receptor RORalpha3等.结论 人膀胱移行细胞癌T24和BIU-87细胞有153个蛋白质的表达发生变化.深入分析这些差异表达蛋白的功能与调控,有望为寻找恶性程度相关的生物学标记物提供重要的实验依据.     

HBV感染诱发AID高表达与肝细胞癌变相关性研究

目的通过研究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)长期感染与诱导性脱氨酶(activation induced deaminase,AID)表达水平的关系探讨肝癌发病机制。方法采用实时定量PCR法,测定乙肝病毒感染及转化生长因子β1(TGF-β1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对Apobec蛋白家族AID和Apobec3G表达量的影响;采用3D-PCR法检测AID、Apobec3G表达组对乙肝病毒基因突变的影响;克隆测序PCR扩增乙肝病毒X基因产物,对比AID和Apobec3G对乙肝病毒基因组突变的影响,计算突变率;并用逆转录病毒携带AID组和对照组在肝脏细胞转染表达后,克隆测序PCR细胞部分基因扩增,对比测定对细胞基因组突变的影响,计算突变率。结果乙肝病毒感染或生长因子TGF-β1刺激使肝细胞中AID表达上调>10倍,TGFβ1刺激组较非刺激组引起乙肝病毒基因组高突变,分别为55个克隆中的16和4个。AID高表达使乙肝病毒基因组高度突变,突变率为55个克隆中的16个,显著高于对照组的1个,多为G到A突变;而且AID高表达使部分细胞基因组如p53和c-myc基因高度突变,突变率分别为8.2×10-5和7.3×10-5,高于对照组的突变率0。结论慢性肝炎病毒感染协同细胞因子诱导AID高表达,高表达的AID使肝炎病毒基因及细胞基因组突变,为肝细胞癌变的相关因素。     

溶酶体跨膜蛋白5在卵巢癌细胞上皮-间质转化中的作用

目的 检测溶酶体跨膜蛋白5 (LAPTM5)在人卵巢腺癌细胞(OVCAR3)中的表达,观察LAPTM5对OVCAR3细胞迁移、侵袭能力的影响,并探讨LAPTM5在上皮-间质转化(EMT)过程中的作用。方法 采用Western blotting检测OVCAR3中LAPTM5的表达情况;将OVCAR3细胞随机分为2组,分别转染空载质粒和LAPTM5沉默质粒,实时定量PCR检测转染效率和EMT相关标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA的表达水平。结果 LAPTM5在OVCAR3细胞中表达上调(P <0.01);与对照组相比,转染LAPTM5沉默质粒的OVCAR3细胞株迁移、侵袭能力明显下降(P <0.05),EMT上皮标志物E-cadherin mRNA表达水平显著上调(P <0.05),间质标志物N-cadherin mRNA和Vimentin mRNA表达下调(P <0.05)。结论 LAPTM5在人卵巢腺癌细胞OVCAR3中表达上调,LAPTM5可能通过EMT影响OVCAR3细胞迁移和侵袭的能力。