突变型K5重组蛋白抑制小鼠肝癌血管生成和肿瘤生长的作用

目的：体内实验观察人纤溶酶原K5缺失突变体Ⅰ（K5 mut1）对HepA小鼠肝癌血管生成和肿瘤生长的影响。 方法:大肠杆菌中表达，组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得K5 mut1蛋白，SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定其表达；建立皮下种植肝癌小鼠模型，腹腔注射不同剂量K5 mut1重组蛋白，检测抑瘤率及肝癌组织微血管密度（MVD）。结果： SDS-PAGE及Western blotting鉴定获得K5 mut1纯化蛋白；K5 mut1剂量依赖性地抑制小鼠肝癌（HepA）实体瘤生长，不同剂量K5 mut1治疗组肝癌组织MVD低于对照组，并随K5 mut1用药剂量增加而降低。 结论： K5 mut1具有抑制小鼠肝癌生长的作用，抑制肿瘤血管生成可能是K5 mut1抑制肿瘤生长的主要机制。结果提示K5 mut1具有治疗肝癌的潜在临床价值。     

高浓度花生四烯酸诱导小鼠成纤维细胞L929凋亡的研究

目的：探讨花生四烯酸是否能诱导小鼠成纤维细胞L929凋亡及其可能机制。方法：噻唑蓝（MTT）法检测细胞存活率,比色法测定乳酸脱氢酶（LDH）释放率,硫代巴比妥酸法测定细胞脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量,Hoechst 33258染色观察凋亡细胞核形态变化,DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA降解。结果：L929细胞在40-160 μmol/L花生四烯酸作用24 h后,细胞存活率明显下降,LDH释放率和细胞MDA含量显著增加（P<0.01）。经160 μmol/L花生四烯酸处理后的L929细胞呈现典型的凋亡核固缩表现。琼脂糖凝胶电泳显示DNA凋亡梯带。结论：高浓度花生四烯酸（80-160 μmol/L）能诱导小鼠成纤维细胞L929凋亡,可能与其促脂质过氧化作用有关。     

人纤溶酶原K5突变体在大肠杆菌中的优化表达

 【目的】 降低成本，增大产出，提高K5突变体（mK5）在原核系统的单位表达量。 【方法】 调整可能影响表达的参数：抗生素浓度、pH、A600值、IPTG终浓度、诱导时间、诱导温度，同时固定其它参数。通过电泳分析，获得mK5在原核系统pET22b-BL21的最优表达条件；组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得mK5蛋白，SDS-PAGE和Western-blot方法鉴定mK5蛋白；MTT法分析mK5对人视网膜毛细血管内皮细胞（HRCEC）增殖的影响。【结果】 优化后的表达条件为：最适细菌培养温度为37℃，最佳抗生素浓度为50μg/mL羧苄青霉素，最适pH值为7.0，在A600为0.9～1.0时加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG为最佳诱导条件，37℃诱导10 h为最佳诱导时间；优化条件后mK5纯化蛋白得率为21 mg/L，产量较优化前(15 mg/L)提高近30％；mK5特异性地抑制HRCEC的增殖，IC50=40 nmol/L。【结论】 本研究确定了mK5蛋白诱导表达的最适参数，并获得具有生物活性的高纯度、高表达量的重组蛋白，为工业化大规模发酵生产提供了基本参数。     

人纤维蛋白溶酶原kringle5(K5)抑制小鼠肝癌的血管生成和肿瘤生长

[目的]体内、体外实验观察人纤维蛋白溶酶原kringle5(K5)对肝癌血管生成和肿瘤生长的影响.[方法]大肠杆菌中表达,组氨酸结合柱亲和层析、纯化获得K5蛋白,SDS-PAGE和Western blot方法鉴定K5蛋白的表达;MTT法分析K5对牛视网膜毛细血管内皮细胞(BRCEC)和肝癌细胞株Bel-7402、HepG2增殖的影响;建立皮下种植肝癌鼠模型,瘤内注射K5,检测抑瘤率及肝癌组织微血管密度(MVD).[结果]SDS-PAGE及Western blot鉴定获得K5纯化蛋白;K5特异性地抑制BRCEC的增殖,IC50=160 nmol/L,而对肝癌细胞株Bel-7402、HepG2的增殖无抑制作用;K5显著抑制小鼠肝癌生长,治疗组肝癌组织MVD明显低于对照组.[结论]K5抑制移植性小鼠肝癌血管生成和肿瘤生长,特异性抑制血管内皮细胞的增殖可能是K5抑制肝癌血管生成的主要机制.K5具有治疗肝癌的潜在临床价值.     

LePtin对缺氧诱导胎肺H型上皮细胞凋亡的影响及机制

目的观察瘦素(LEP)对缺氧诱导胎鼠肺Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)凋亡的拮抗作用,并探讨其机制.方法采用改良免疫黏附法原代培养胎鼠AECⅡ细胞,并用SP-A免疫细胞化学法和透射电镜进行鉴定;用含5 mmol/L连二亚硫酸钠(Na2S2O4)培养液培养AECⅡ细胞12 h建立缺氧诱导细胞凋亡模型,处理组含不同浓度LEP(100-1 600 μg/L);噻唑兰(MTT)比色法检测细胞存活情况;流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期;蛋白质免疫印迹法(Western blotting)检测凋亡蛋白caspase 3的表达.结果采用免疫黏附法获得高纯度原代培养的AECⅡ细胞,免疫细胞化学法示SP-A阳性表达,电镜下可见细胞内特征性板层小体;5 mmol/L Na2S2O4能诱导AECⅡ细胞凋亡和caspase 3活化,LEP(100-1 600 μg/L)能减轻Na2S2O4所致的细胞损伤,表现为AECⅡ存活率提高、增殖指数(PI)增高及凋亡峰下降、细胞形态恢复和caspase 3活化受抑制.结论LEP可拮抗缺氧所致AECⅡ细胞凋亡,这可能与其促使细胞周期从G1期进入S期及抑制凋亡蛋白caspase 3活化有关.     

藏红花素诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及其作用机制

目的:研究藏红花素对HeLa细胞的促凋亡作用和机制.方法:设置0、02、0.4及0.8 mmol/L 4个浓度梯度,MTT法分析不同浓度藏红花素对HeLa细胞增殖的影响;设置空白阴性对照及秋水仙素(10 μg/L)阳性对照,向HeLa细胞培养物分别加入0.4和0.8 mmol/L的藏红花素,培养48 h后用PI/AnnexinⅤ双染法分析其凋亡情况;1.6 mmol/L藏红花素作用于HeLa细胞72 h后,蛋白质印迹法检测Caspase-3的切割.结果:MTT实验分析显示,在0、0.2、0.4及0.8 mmol/L浓度下HeLa细胞存活率分别为1、0.964、0.796和0.586.藏红花素显著地抑制HeLa细胞生长,P<0.05;各浓度组间均差异有统计学意义,P<0.05.PI/Annexin V双染法、流式细胞仪检测显示,阴性对照组、10μg/L秋水仙素阳性对照组、0.4及0.8 mmol/L藏红花素处理组的细胞凋亡率分别为3.64%、15.99%、4.86%和9.28%,藏红花素促进HeLa细胞凋亡.蛋白质印迹法检测显示,藏红花素促进HeLa细胞Caspase-3切割.结论:藏红花素可明显地抑制HeLa细胞生长,并通过增加HeLa细胞Caspase-3切割促进其凋亡.     

人纤溶酶原K5体内抑制Lewis肺癌肿瘤生长与转移

【目的】通过体内实验探讨人纤溶酶原Kringle 5（K5）对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长与转移的抑制作用。【方法】采用腋下接种肿瘤细胞的方法建立Lewis肺癌细胞皮下种植瘤小鼠模型,分为PBS对照组和K5治疗组,观察各组肿瘤生长情况,测量肿瘤大小,制备小鼠体质量-时间曲线和肿瘤体积-时间曲线;采用皮下种植瘤剔除术建立Lewis肺癌自发性肺转移模型,术后分为PBS对照组和K5治疗组,观察各组小鼠肺组织转移瘤数量,取肺组织进行病理学分析。【结果】在皮下种植瘤模型中,与对照组相比,K5治疗组小鼠肿瘤体积-时间曲线变化平缓,肿块增长缓慢,肿瘤质量明显降低[分别为（4.57&#177;0.79）g和（1.15&#177;0.31）g,P=0.006];在Lewis肺癌转移瘤模型中,K5治疗组小鼠肺表面转移瘤结节数[分别为（15.75&#177;9.79）个和（6.60&#177;3.39）个,P=0.029]以及肺湿质量明显少于对照组,高倍镜下治疗组肺微转移灶数目亦较少。【结论】人纤溶酶原K5能显著抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长,并能明显抑制Lewis肺癌细胞转移。     

人纤溶酶原K5体内抑制Lewis肺癌肿瘤生长与转移

 【目的】 通过体内实验探讨人纤溶酶原Kringle 5(K5)对小鼠Lewis肺癌移植瘤生长与转移的抑制作用?【方法】 采用腋下接种肿瘤细胞的方法建立Lewis肺癌细胞皮下种植瘤小鼠模型,分为PBS对照组和K5治疗组,观察各组肿瘤生长情况,测量肿瘤大小,制备小鼠体质量-时间曲线和肿瘤体积-时间曲线;采用皮下种植瘤剔除术建立Lewis肺癌自发性肺转移模型,术后分为PBS对照组和K5治疗组,观察各组小鼠肺组织转移瘤数量,取肺组织进行病理学分析?【结果】 在皮下种植瘤模型中,与对照组相比,K5治疗组小鼠肿瘤体积-时间曲线变化平缓,肿块增长缓慢,肿瘤质量明显降低[分别为(4.57 ± 0.79) g和 (1.15 ± 0.31) g,P=0.006];在Lewis肺癌转移瘤模型中,K5治疗组小鼠肺表面转移瘤结节数[分别为(15.75 ± 9.79) 个和 (6.60 ± 3.39) 个,P=0.029]以及肺湿质量明显少于对照组,高倍镜下治疗组肺微转移灶数目亦较少?【结论】 人纤溶酶原K5能显著抑制小鼠Lewis肺癌移植瘤的生长,并能明显抑制Lewis肺癌细胞转移?     

高校实验动物中心动物质量控制研究与创新实践

目的 实验动物质量直接关系着研究和评价数据的准确性和可重复性,亦是公共卫生安全的主要部分。方法 针对高校动物中心来源复杂、人员流动性大、需求多样等特点,从管理体系建立和病原检测角度提升实验动物质量。结果 建立并执行了实验动物准入制度、哨兵动物监测制度、动物用品监测制度等系列管理体系,自2018年以来,检测了1481批次非活体动物样本,106批次病原阳性,检测了395例活体动物样本,38例病原阳性,检测了363份动物相关用品。结论 禁止了数批烈性传染病病原阳性动物的进入、严密监视了条件致病菌阳性动物的来源单位、及时调整和更新了大小鼠监测病原谱,从而提升了实验动物质量。     

Leptin对缺氧诱导胎肺Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响及机制

目的： 观察瘦素(LEP)对缺氧诱导胎鼠肺Ⅱ型上皮细胞（AECⅡ）凋亡的拮抗作用，并探讨其机制。方法： 采用改良免疫黏附法原代培养胎鼠AECⅡ细胞，并用SP-A免疫细胞化学法和透射电镜进行鉴定；用含5 mmol/L连二亚硫酸钠（Na₂S₂O₄）培养液培养AECⅡ细胞12 h建立缺氧诱导细胞凋亡模型，处理组含不同浓度LEP（100-1 600 μg/L）；噻唑兰（MTT）比色法检测细胞存活情况；流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期；蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测凋亡蛋白caspase 3的表达。结果： 采用免疫黏附法获得高纯度原代培养的AECⅡ细胞，免疫细胞化学法示SP-A阳性表达，电镜下可见细胞内特征性板层小体；5 mmol/L Na₂S₂O₄能诱导AECⅡ细胞凋亡和caspase 3活化，LEP（100-1 600 μg/L） 能减轻Na₂S₂O₄所致的细胞损伤，表现为AECⅡ存活率提高、增殖指数（PI）增高及凋亡峰下降、细胞形态恢复和caspase 3活化受抑制。结论： LEP可拮抗缺氧所致AECⅡ细胞凋亡，这可能与其促使细胞周期从G₁期进入S期及抑制凋亡蛋白caspase 3活化有关。