成人教育病理生理学分块讲座式教学改革初探

为了更好地激发成人医学教育的学生学习《病理生理学》的兴趣，提高他们的临床思维能力、实践能力和分析问题的能力，并增强其探索意识，中南大学基础医学院病理生理学系，在成人教育2006级专升本业余班病理生理学教学过程中实施了“分块讲座式教学”。本文就病理生理学“分块讲座式教学”的初步实践进行了调查分析，说明该项改革符合成人教育的特点，受到学生和教师的一致好评。     

靶向核仁素RNA干扰载体的构建与筛选

目的:设计靶向大鼠核仁素的RNAi序列,构建6个RNAi真核表达载体,采用转染工具细胞筛选有效靶点.方法:根据GenBank中的核仁素序列,设计特异性siRNA序列,将模板序列克隆至pGCsilencerTMU6/Neo/GFP质粒中,通过测序鉴定后,将重组质粒用脂质体转染技术导入H9C2细胞,荧光显微镜检测GFP表达以判断转染效率,Western-blot检测靶细胞中核仁素蛋白水平的表达,筛选有效干扰序列.结果:经测序鉴定,克隆的RNAi打靶序列完全正确,无碱基突变.转染H9C2细胞36 h后,荧光显微镜下可检测到GFP标记的核仁素蛋白的表达,转染效率达75%以上.Western-blot结果显示3号核仁素干扰质粒(Ncl-3)能明显下调H9C2细胞的核仁素表达.结论:成功构建靶向核仁素RNA干扰载体,并筛选出效能最优序列,为进一步相关研究奠定基础.     

膜表面核仁素对内毒素所致THP-1细胞炎症介质表达的影响

目的探讨THP-1细胞膜定位核仁素作为寡糖链受体在脂多糖所致炎症反应中的作用。方法采用间接免疫荧光、流式细胞术以及细胞膜蛋白免疫印迹等技术证实核仁素在人THP-1细胞膜表面表达。以无血清状态下脂多糖刺激THP-1细胞为炎症细胞模型，采用逆转录聚合酶链反应及酶联免疫吸附测定法等检测核仁素抗体对炎症介质肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的表达与分泌的影响。结果间接免疫荧光、流式细胞术以及免疫印迹证实核仁素可在人THP-1细胞膜表面表达。逆转录聚合酶链反应结果发现，在无血清条件下，500μg/L脂多糖刺激1h、2h、3h或4h后可以明显促进肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达，而核仁素抗体处理1h后再用脂多糖刺激1h、2h、3h或4h，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达明显受到抑制。而先用正常IgG体处理1h后再用脂多糖刺激1h、2h、3h或4h，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达与单用脂多糖刺激水平相当。另外单用正常IgG或核仁素抗体处理1～4h，肿瘤坏死因子α和白细胞介素1βmRNA表达与对照组比较无差异。酶联免疫吸附测定法检测发现，核仁素抗体处理1h后能明显抑制脂多糖所致肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β的分泌，而IgG则没有这种作用。结论THP-1细胞膜表面核仁素参与了脂多糖所致炎症反应，提示核仁素可能是脂多糖的一种新受体。     

大鼠压力负荷增加心肌肥厚模型中核仁素的表达

目的：探讨腹主动脉缩窄致压力负荷增加大鼠心肌肥厚模型中核仁素的表达情况。方法：采用体质量
180~220 g SD大鼠40只,随机分为假手术组和腹主动脉缩窄模型组,利用腹主动脉缩窄法制备压力负荷增加心肌肥
厚模型,分别于术后2周、4周观察心脏质量指数、左心室质量指数;采用RT-PCR检测心肌组织中-MHC mRNA的
表达;采用Western印迹检测心肌、脑、肾组织中核仁素的表达情况。结果：腹主动脉缩窄模型组4周以后心脏质量
指数、左心室质量指数较假手术组显著增加(P<0.01);4周以后心肌组织中-MHC mRNA的表达较假手术组显著升高
(P<0.05);2周以后心肌组织中核仁素蛋白的表达较假手术组显著升高(P<0.05),而在脑、肾组织中无明显升高。结论：
核仁素蛋白在大鼠压力负荷增加心肌肥厚模型中的表达上调,表明核仁素可能参与了压力负荷增加心肌肥厚的发生
发展。     

核仁素对LPS诱导的白细胞介素1β释放的影响

目的: 探讨核仁素在脂多糖(LPS)所致炎症模型中的表达及其对LPS所致的白细胞介素1β(IL-1β)释放的影响。方法: 小鼠腹腔注射LPS(15 mg/kg)建立内毒素血症模型,LPS(500 μg/L)处理建立RAW264.7细胞炎症模型,采用免疫印迹观察核仁素在炎症模型中的表达。利用瞬时转染技术抑制或增加RAW264.7细胞内核仁素表达后,LPS处理,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养基中IL-1β的含量。结果: 在内毒素血症小鼠的肺组织和RAW264.7细胞炎症模型中,110 kD核仁素表达上调,80 kD核仁素片段表达减少。与转空载体对照组比较,核仁素过表达组LPS所致的IL-1β释放明显增加(P<0.05);与正常细胞组和随机寡核苷酸组比较,核仁素低表达组LPS所致的IL-1β释放明显减少(P<0.05)。结论: 在LPS所致的炎症模型中,110 kD核仁素表达上调, 80 kD核仁素片段表达减少;核仁素促进LPS所致的IL-1β释放。     

内环境系统CBL课改革后的教学效果调查分析

目的 调查内环境系统CBL课改革后的教学效果,为完善相关讨论课的教学方法并提高其教学质量提供参考依据。方法 以中南大学湘雅医学院2届八年制临床医学生190名和五年制临床医学卓越医师班学生60名为调查对象,对所实行的“课堂现场分段研读病例辩论赛式讨论”改革方案教学效果进行调查。调查表内容包括：对改革方案特点和优势的看法、学生喜爱支持这次改革的理由等。采用无记名问卷调查,运用Excel和SPSS17.0统计软件收集、处理数据,描述性分析计算各指标百分率。结果 ①学生认为这改革方案所具有的优势体现在以下几个方面：减轻学生负担78.5%、提高学生参与积极性85.4%、提高课堂讨论质量80.5%、增强学生的团结协作精神78.5%、扩大学生思考探索空间84.3%、该模式与临床诊疗过程接近84.0%;②学生喜爱支持这改革方案的主要理由有：减轻了学生负担83.4%、提高了课堂讨论质量72.4%、培养了学生挖掘临床信息的能力82.4%。结论 该讨论课改革方案,减轻了学生负担,提高了讨论课教学质量,深受学生欢迎,对其他各课程的讨论课开展也有积极的参考价值。     

热休克预处理抑制过氧化氢所致C2C12肌原细胞释放天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活物及细胞凋亡

为探讨热休克预处理对过氧化氢所致C2C12肌原细胞凋亡和第二种线粒体释放的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活物从线粒体释放的影响，采用0.5mmol／L过氧化氢作用于C2C12肌原细胞。Hoechst33258荧光染色，观察细胞形态学改变并计算凋亡百分率，抽提DNA作琼脂糖电泳，以确定细胞凋亡情况。采用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶活性定量检测试剂盒及蛋白质印迹观察天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9的活化情况。采用免疫荧光及细胞成分分离后蛋白质印迹检测第二种线粒体释放的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活物从线粒体的释放。结果发现，过氧化氢处理1～2h，第二种线粒体释放的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活物逐渐从线粒体释放入胞浆；处理4h天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9活性升高，12h达高峰；处理24h细胞明显出现凋亡，凋亡百分率明显升高。热休克预处理可诱导C2C12肌原细胞中热休克蛋白90，热休克蛋白70及αβ-晶状体蛋白的表达增高：抑制第二种线粒体释放的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活物释放、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9的活化及细胞凋亡的发生。结果提示，线粒体信号通路在过氧化氢所致的心肌细胞凋亡中发挥重要作用；热休克预处理通过抑制上述通路而减轻过氧化氢所致的细胞凋亡，其机制与其诱导热休克蛋白表达、阻断第二种线粒体释放的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活物从线粒体向胞浆释放、从而抑制天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3，天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶9的活化有关。     

心肌组织特异性高表达核仁素转基因小鼠的构建与鉴定

 目的：构建并鉴定心肌组织特异性高表达核仁素(Ncl)的转基因小鼠,为从整体水平上研究核仁素对心肌功能的影响及其发挥心肌保护作用的机制提供动物模型。方法：采用基因重组法将小鼠核仁素基因的全长cDNA插入含心肌细胞特异性启动子的Alpha-MyHC clone 26载体,构建Alpha-MyHC clone 26-Ncl重组载体,通过双酶切及基因测序鉴定其正确性;采用PCR鉴定阳性小鼠并用Western blotting法观察转基因小鼠中核仁素的表达情况,采用组织切片及HE染色法观察转基因小鼠心肌组织形态;测量心脏重量指数和左室压最大上升速率,观察核仁素在心肌组织高表达后对小鼠心脏形态功能是否有影响。结果：PCR法观察显示获得4只阳性小鼠(51、52、56和86,其中52和86系繁殖良好）,Western blotting结果表明转基因小鼠的核仁素表达量明显高于野生鼠,HE染色等结果表明核仁素对心肌形态学、心脏/体重比值及心功能无明显影响。结论：成功制备了心肌组织特异性高表达核仁素的转基因小鼠,与野生型小鼠相比,转基因小鼠心肌形态及心功能无明显差异。     

膜表面核仁素对脂多糖所致TNF-α和IL-1β表达的影响

目的：观察人THP-1细胞膜表面核仁素对脂多糖（LPS）所致TNF-α和IL-1β表达的影响。方法：采用免疫荧光、免疫印迹等方法观察核仁素在THP-1细胞膜表面表达。利用抗体封闭策略使膜表面核仁素失活,以LPS刺激THP-1细胞的炎症细胞模型,采用逆转录PCR和酶联免疫吸附实验观察炎症因子TNF-α和IL-1β的表达与分泌。结果：免疫荧光结果显示核仁素呈斑点状位于细胞膜表面;免疫印迹检测显示核仁素和Fas存在于THP-1细胞膜蛋白中。逆转录PCR结果显示LPS（1000μg/L）处理1,2,3,4h后,IL-1β和TNF-α mRNA均表达上调,而核仁素抗体封闭明显抑制二者的表达。酶联免疫吸附检测发现,LPS（1mg/L）刺激4,12,24h后,促进THP-1细胞分泌TNF-α和IL-1β,而核仁素抗体封闭显著抑制LPS所致的炎症因子释放（P〈0.05）。结论：THP-1细胞膜表面核仁素参与介导LPS所致早期炎症介质IL-1β和TNF-α的表达与分泌。     

过氧化氢对K562细胞凋亡的影响

目的 :探讨活性氧对K5 6 2细胞凋亡的影响。方法 :用过氧化氢 (hydrogenperoxide ,H2 O2 )作用于对数生长期的K5 6 2细胞。结果 :Hoechst 332 5 8染色法观察到K5 6 2细胞明显凋亡 ;caspase活性定量测定及WesternBlotting检测显示caspase 3, 8, 9同时被激活。结论 :H2 O2 可诱导K5 6 2细胞凋亡 ,且通过同时激活线粒体途径和死亡受体途径起作用。