HMGB1不同结构域对CVB3心肌炎疫苗免疫增强作用的比较研究

目的本研究在已构建好的柯萨奇病毒B3型(CVB3)疫苗pVP1的基础上,分别引入编码HMGB1不同结构域的质粒DNA,通过检测共免疫诱导的免疫应答强度,比较其各结构域介导的免疫增强作用。方法首先构建了编码HMGB1的不同结构域的质粒pHMGB1-A、B、C-box,分别与pVP1疫苗混合后肌注免疫小鼠,于末次免疫后10 d检测其诱导的特异性抗体和细胞免疫应答。结果与pVP1单独免疫组相比,pHMGB1-B box共免疫组可显著提高特异性血清IgG水平,同时也显著增加了脾脏IFN-γ+T的细胞数量;C-box仅显示出促进T细胞免疫的效应且程度较B-box小,对抗体水平无明显增强作用;A-box对抗体水平和细胞免疫应答的促进作用都不明显。结论 HMGB1不同结构域对病毒性心肌炎DNA疫苗诱导的体液和细胞免疫应答具有不同程度的增强效应,其中B-box可综合增强CVB3特异性体液和细胞免疫应答,C-box仅有促进T细胞应答效应,而对抗体水平无促进作用,A-box对抗体水平增加和细胞免疫应答的促进作用不明显。该研究不仅有助于深入了解HMGB1不同结构域的免疫佐剂效果差异,更为科学合理应用HMGB1增强免疫应答提供了一定的基础数据。     

HMGB1促进外源DNA诱导细胞产生Ⅰ型干扰素

目的探讨HMGB1在外源DNA-poly(dA-dT)刺激细胞Ⅰ型干扰素IFN-β中的作用。方法荧光素酶分析方法检测经poly(dA-dT)刺激后细胞IFN-β的表达差异,同时PCR法检测了胞内重要DNA结合蛋白—高迁移率族蛋白-1(HMGB1)的表达改变;构建携带HMGB1特异性shRNA的慢病毒载体,获得HMGB1稳定下调(HMGB1KD)细胞,经poly(dA-dT)刺激后检测IFN-β表达,分析HMGB1在外源DNA刺激IFN-β产生中的作用。结果 poly(dA-dT)刺激293T细胞后,IFN-β表达显著上调,同时,HMGB1的表达在不同细胞中也明显上升,当下调HMGB1后,poly(dA-dT)刺激IFN-β产生的能力大幅削弱,表达水平降至对照组的1/8(P<0.05)。结论 HMGB1在促进外源DNA诱导Ⅰ型干扰素产生中发挥了关键作用。     

CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠模型中CD4~+T细胞亚群格局及其作用

本研究主要关注BALB/c小鼠感染柯萨奇病毒B3型(CVB3)后CD4+T细胞亚群格局的变化及其对病毒性心肌炎发病的贡献度。CVB3腹腔感染小鼠后第7d,通过小鼠体重下降率、心肌损伤血清学指标肌酸激酶(CK)活性以及心肌组织病理学改变等多项指标证实小鼠心肌炎模型的成功建立。经Real-time PCR检测感染第7d脾脏CD4+T细胞亚群主要细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17A、IL-17F及转录因子Foxp3表达情况;以流式细胞术检测了CD4+T细胞各亚群比例,并通过多元线性回归分析法评估了各T细胞亚群对病毒性心肌炎发病的影响。结果显示,与对照组相比,CVB3感染小鼠脾脏IL-17A、IL-17F、IFN-γ表达均显著上升(分别约为12、8.5、5倍),而IL-4和Foxp3表达无明显变化。CVB3感染小鼠脾脏中CD4+IL-17+Th17细胞的上调幅度最为明显,约2.75倍,其次为IFN-γ+Th1细胞,上调约2.27倍,而Th2和Treg细胞无明显变化。进一步统计学分析显示,Th17对病毒性心肌炎发病的贡献度最高(1.808),Th1次之,贡献度为1.581,而Th2和Treg对病毒性心肌炎发病无显著影响,提示CD4+T细胞亚群格局变化与病毒性心肌炎发病密切相关,其中以Th17对心肌炎发病的贡献度尤为显著。     

重组水疱性口炎病毒载体疫苗皮下免疫效应的初步研究

柯萨奇B组病毒(CVB3)是导致人类急慢性心肌炎、扩张性心肌病的重要病原体之一。目前还没有疫苗或有效的药物防治病毒性心肌炎,我们观测了以水疱性口炎病毒VSV为载体的疫苗皮下免疫诱导的CVB3特异性免疫应答及保护效果,并比较了与传统蛋白疫苗之间的差异。以VSV为载体的病毒疫苗在小鼠模型中通过皮下免疫可以诱导强劲的体液免疫和T细胞免疫,但与VP1蛋白疫苗比较,除了分泌IFN-γ的T细胞外差异无统计学意义。VSV-VP1免疫组(一次免疫)的保护效果略好于VP1蛋白免疫组(三次免疫),提示VSV-VP1疫苗保护效果增加的可能原因是VSV-VP1皮下免疫诱导的特异性分泌IFN-γ的T细胞的比例增加,以上实验结果为水疱性口炎病毒作为疫苗载体应用提供了理论基础。     

MDSCs诱导调节性T细胞改善CVB3诱导的病毒性心肌炎

目的探讨骨髓来源抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)在CVB3诱导的病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)中的保护作用。方法通过流式细胞术分选获得足量MDSCs,体外证实具有免疫抑制功能后行体内转输实验,观察疗效及免疫机制。结果与对照PBS组相比,MDSCs处理组体质量呈上升趋势,肌酸激酶(CK)活性明显降低(P<0.001),心脏局部炎症浸润及坏死病灶显著减少,7天生存率高达70%(P<0.01),而心肌病毒滴度无明显改变,却上调了CD4+FoxP3+调节性T细胞比例。结论 MDSCs可显著改善CVB3诱导的病毒性心肌炎,有望成为心肌炎防治的新型策略和手段。