人重组胱天蛋白酶原-3的表达和体外活化

目的:建立一个在短时间内获取大量活化胱天蛋白酶-3的方法.方法:将胱天蛋白酶-3酶原的基因从真核表达载体中克隆到原核表达载体pMTY4-His中,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达MS2-胱天蛋白酶原-3融合蛋白;将包涵体变性,经酸化和浓缩进行体外活化;对所得蛋白用Western blot和活性试验进行鉴定.结果:构建成pMTY4-His-胱天蛋白酶-3原核表达载体,在大肠杆菌中获得了较高水平表达的胱天蛋白酶原-3酶原-MS2融合蛋白.体外活化后每升诱导菌可获得约10 mg蛋白,用抗胱天蛋白酶-3单克隆抗体证实所得蛋白为胱天蛋白酶原-3,活性试验证实得到高活性的蛋白.结论: 成功地建立了大量获取高活性的胱天蛋白酶-3的方法,为深入研究胱天蛋白酶-3的功能和性质提供物质基础.     

人重组粒细胞集落刺激因子突变体的构建、表达和其体内外生物学活性研究

目的为提高人重组粒细胞集落刺激因子（ｈｕｍａｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ,ｒｈＧ－ＣＳＦ）的稳定性和活性,对ｒｈＧ－ＣＳＦ进行改造和体内、外活性研究。方法利用定向点突变技术,将人重组粒细胞集落刺激因子第１７位游离的半胱氨酸编码序列突变为丙氨酸序列,ＤＮＡ序列分析证明后,在大肠杆菌中表达突变蛋白。利用Ｇ－ＣＳＦ依赖细胞株ＮＦＳ－６０,对在不同温度及在人血浆中保存的Ｇ－ＣＳＦ蛋白（Ｇ－ＣＳＦ－Ａｌａ１７）和野生型的Ｇ－ＣＳＦ进行活性测定。腹腔注射后小鼠外周血白细胞计数检测其体内生物学活性。结果ＤＮＡ序列分析表明１７位半胱氨酸突变为丙氨酸,并在大肠杆菌中表达成功Ｇ－ＣＳＦ－Ａｌａ１７。纯化的突变蛋白对ＮＦＳ－６０细胞具有刺激活性;与野生型Ｇ－ＣＳＦ相比,在各种温度储存的突变蛋白保留更高的活性,与人血浆孵育５０小时后突变蛋白仍保持活性;小鼠一次性体内注射突变蛋白后外周血白细胞数明显高于野生型Ｇ－ＣＳＦ。结论Ｇ－ＣＳＦ突变体（Ｇ－ＣＳＦ－Ａｌａ１７）较野生型的Ｇ－ＣＳＦ具有更高的体外稳定性和体内造血刺激活性。     

趋化因子新变异体MPIF-1β重组蛋白的纯化和活性分析

目的 为深入研究趋化因子新变异体MPIF-1β的结构与功能，利用pKPL3a-MPIF-1β表达质粒进行原核表达，纯化工艺研究及活性检测。方法 MPIF-1β重组蛋白以包涵体形式存在，占总菌体蛋白的15%，工程菌经超声破碎，包涵体洗涤，变性，复性，肝素SepharoseCL-6B亲和层析，CMSepharose Fast Flow和SeplarylS-200层析分离获得目的蛋白。结果 还原SDS-PAGE分析相对分子质量15000u，纯度99.0%，纯化倍数6.6倍，总回收率9.07%，体外生物学活性检测证明MPIF-1β重组蛋白对小鼠骨髓集落形成具有抑制作用，对U937细胞具有趋化活性，且呈一定的剂量依赖关系。结论 建立了简便可行的MPIF-1β重组蛋白纯化路线，初步证明了MPIF-1β的生物学活性。     

人重组粒细胞集落刺激因子突变体rhG-CSF-Ala-17的纯化及部分理化性质

目的:建立高效简便的人重组粒细胞集落刺激因子突变体rhG-CSF-Ala-17纯化工艺,并对其进行鉴定.方法:大肠杆菌表达的rhG-CSF-Ala-17经包涵体洗涤、变性复性后,采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Superdex75凝胶过滤层析分离纯化.经SDS-PAGE和FPLC检测纯度,并进行N端氨基酸序列分析、比活性分析、紫外最大吸收光谱分析、内毒素检测等指标对其进行鉴定.结果:纯化后的rhG-CSF-Ala-17纯度可达99.64%,比活为1×108 U*mg-1.其N端19个氨基酸分析与预期序列一致,紫外最大吸收光谱位于280 nm,氨基酸的组成与预期结果一致,内毒素含量低于部颁标准.结论:两步层析即可获得高纯度的rhG-CSF-Ala-17重组蛋白质,为进一步的rhG-CSF-Ala-17临床前和临床研究打下了基础.     

直接加压输卵管通液术92例临床分析

直接加压输卵管通液术９２例临床分析广东揭阳榕城妇幼保健院（５２２０００）刘瑞吟莫晓宁王懿我院自１９７９年１０月至１９９３年１０月，应用直接加压输卵管通液术（下称加压法），治疗输卵管阻塞性不孕症５６例及输卵管吻合术后吻合口粘连狭窄３６例，效果满意，现报...     

髓样造血抑制因子(MPIF)存在一种新的mRNA剪切变异体

目的　克隆并原核表达趋化因子 ,研究其结构与功能。方法　RT PCR技术 ,DNA测序和计算机网上比对 ,DNA重组及原核表达技术 ,离子交换层析技术 ,半固体骨髓集落培养。结果　在利用RT PCR扩增趋化因子MPIF 1的过程中发现存在一种新的变异体形式。该变异体比MPIF 1多5 1个碱基 ,编码的蛋白质比MPIF 1长 17个氨基酸 ,基因定位于人类第 17号染色体上 ,其序列符合内含子和外显子的剪切规律 ,因而很可能为MPIF 1的mRNA不同剪切形式 ,将其命名为MPIF 1β。应用DNA重组技术构建原核表达质粒PKPL MPIF 1β ,转化大肠杆菌 ,诱导表达 ,获得重组蛋白。SDS PAGE表明MPIF 1β的表达效率达 15 % ,相对分子质量 (Mr)约为 (14～ 15 )× 10 3。功能研究表明 ,MPIF 1β有抑制小鼠骨髓集落形成的作用。结论　MPIF 1β是与MPIF 1功能类似的新变异体。     

浅谈地方院校食品专业大学生的营养教育与创新实践

就国内外营养教育的现状进行分析,并以地方院校食品专业为例,从营养知识教育与食品相关科目的融合、食品营养健康社团的建设和大学生在食品营养健康社团中的创新与实践3个方面探讨大学生的营养教育与创新实践,为我国大学生营养教育的深入研究提供参考。     

重组凋亡相关蛋白PDCD5的纯化及稳定性

目的：建立简便、有效的原核表达促凋亡相关蛋白PDCD5的纯化路线，获得高纯度的PDCD5蛋白，并观察其稳定性。方法：以包涵体形式表达的PDCD5融合蛋白，经包涵体洗涤、变性、复性、酶切、DEAE Sepharose Fast Flow和Sephacryl S-200两步层析分离获得PDCD5蛋白。选用毛细管电泳方法检定蛋白质纯度，SDS—PAGE检定蛋白质的稳定性。结果：经毛细管电泳方法检测PDCD5蛋白纯度为100％，相对分子质量15800，等电点5．9。生物学活性分析PDCD5蛋白能够促进撤除细胞因子的HL-60细胞的凋亡，呈现一定的量效关系。稳定性研究发现储藏中的PDCD5蛋白不稳定，对温度敏感，4℃和25℃极易降解，而-20℃和冻干保存则相对稳定。结论：本研究建立的蛋白纯化方法可以获得大量、高纯度PDCD5蛋白。稳定性实验提示PDCD5宜在-20℃以下或冻干保存。     

人重组粒细胞集落刺激因子突变体的构建,表达和其 …

目的 为提高人重组炷细胞集落刺激因子（ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ,ｒｈＧ－ＧＳＦ）的稳定性和活性,对ｒｈＧ－ＧＳＦ进行改造和体内、外活性研究。方法 利用定向点突变技术,将人重组粒细胞集落刺激因子第１７位游离的半胱氨酸编码序列突变为丙氨酸序列,ＤＮＡ序列分析证明后,在大肠杆菌中表达突变蛋白。利用Ｇ－ＣＳＦ依赖细胞株ＮＦＳ     

人重组核凋亡诱导因子1截短体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的：核凋亡诱导因子1（Nuclear apoptosis—inducing factorj，NAIF1）是本实验室首次克隆和鉴定的新凋亡基因，为了通过Polldown实验研究其结合蛋白，在大肠杆菌中表达和纯化人重组NAIF1（73-327）的截短体。方法：通过PCR方法扩增出NAIF1（73—327）cDNA，并插入pGEX—KG载体，实现插入基因的融合表达，对表达产物进行SDS—PAGE、Western blot和电喷雾电离-四极杆-飞行时间质谱（ESI—Q-TOF—MS／MS）检测分析。结果：DNA测序结果证实成功构建了重组融合表达质粒pGEX—KG—NAIF1（73-327），并在大肠杆菌中稳定表达，表达产物分子量约为53kD，与预期一致，表达量约占菌体总蛋白的22％，纯化蛋白经Western blot和二级质谱（MS／MS）分析证明表达蛋白为GST—NAIF1（73-327）融合蛋白。结论：获得了重纩GST—NAIF1（73-327）融合蛋白的高效表达，为下阶段NAIFl的结构与功能研究打下了基础。