重组泛素连接酶SH2-U-box/RING的构建与表达

目的 构建重组泛素连接酶SH2-U-box、SH2-RING,并克隆进入pFlag-CMV4真核表达载体,为研究靶向降解慢性粒细胞白血病(chronic myelocytic leukemia,CML)患者瘤细胞中过度活化的BCR/ABL,抑制肿瘤细胞的生长提供基础.方法 设计引物,扩增接头分子Grb2的SH2结构域以...     

肠道菌群在新冠肺炎中的作用及以肠道菌群为靶标的治疗

由严重急性呼吸系统综合征2型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的2019冠状病毒病(COVID-19)目前在全球范围蔓延严重。新冠肺炎患者除了通常会出现发热和严重的呼吸系统症状,部分患者会出现腹泻、呕吐、恶心、厌食和腹痛等胃肠道症状,目前仍缺乏有效的抗病毒药物用于该病的治疗。中医经典理论“肺与大肠相表里”与现代医学的“肺-肠轴”相吻合,提示调节肠道菌群稳态的相关产品可能有助于控制这种病毒感染。文章就肠道菌群与呼吸道病毒性疾病的关系、利用益生菌和营养疗法平衡肠道菌群、调节免疫应答从而对COVID-19患者进行治疗等问题进行综述,为治疗COVID-19寻找替代途径。     

迁移和侵袭抑制蛋白(MIIP)荧光素酶报告基因稳定共表达HCT116~(MIIP-Luc)结肠癌细胞系的建立

目的建立迁移和侵袭抑制蛋白(MIIP)荧光素酶报告基因稳定过表达的结肠癌HCT116细胞系,为MIIP基因的在体功能研究提供细胞模型。方法将MIIP基因插入慢病毒载体p LEX-MCS-HA中获得重组慢病毒载体p LEX-MCS-HA-MIIP。利用该重组载体p LEX-MCS-HA-MIIP及包装载体VSVG、△8.9,共转染HEK293T细胞,包装表达MIIP的慢病毒,将其感染HCT116细胞后,采用适宜浓度的嘌呤霉素筛选,建立MIIP稳定过表达的HCT116细胞。利用表达荧光素酶报告基因的慢病毒进行二次感染,建立MIIP和荧光素酶报告基因稳定共表达的HCT116MIIP-Luc细胞和仅表达荧光素酶报告基因的HCT116Luc细胞。利用实时荧光定量PCR检测MIIP的mRNA水平,Western blot法检测MIIP蛋白水平,小动物活体成像技术观察HCT116MIIP-Luc细胞和HCT116Luc细胞的荧光强弱。结果成功建立了MIIP荧光素酶报告基因稳定共表达的HCT116MIIP-Luc细胞和仅表达荧光素酶报告基因的HCT116Luc细胞,在HCT116MIIP-Luc细胞中实现了MIIP过表达,生物发光成像结果显示HCT116MIIP-Luc细胞和HCT116Luc细胞均可产生较强的荧光。结论分别建立了可传代的MIIP过表达及荧光素酶报告基因稳定共表达的结肠癌HCT116细胞株。     

人异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）R132 H突变型脑胶质瘤细胞的原代培养及鉴定

目的：建立简单、方便、高效的异柠檬酸脱氢酶1（IDH1）突变型胶质瘤原代细胞体外培养方法,为研究IDH1突变型脑胶质瘤提供细胞模型。方法：样本组织取自低级别脑胶质瘤手术患者,采用组织块法行原代细胞培养,倒置显微镜下观察细胞形态特点;瘤组织应用苏木精－伊红染色法（HE ）和免疫组织化学染色确定胶质瘤病理类型以及级别;原代细胞提取基因组行碱基序列测序以鉴定IDH1突变类型;采用MTT法绘制生长曲线,检测IDH1突变型细胞的体外增殖特性。结果：成功建立WHOⅡ级IDH1 R132H突变型人脑星形胶质细胞瘤细胞株,并可传代。结论：应用合适的方法以及培养液,可以培养出IDH1 R132H突变型人脑胶质瘤原代细胞。     

小鼠α1,3-半乳糖糖基化修饰对人肝癌HuH7细胞生物学特性的影响

目的：探讨利用小鼠α1,3半乳糖基转移酶基因进行肝癌基因治疗的可行性。方法：将pcDNA3.1-α1,3GT真核表达载体以脂质体介导法转染人肝癌细胞HuH7,经G418压力筛选出稳定表达的阳性克隆,经生长曲线法,平板克隆形成试验,流式细胞仪等试验分析稳定表达株相关生物学特性变化。结果：转染有α1,3GT的HuH7经RT-PCR法检测到有α1,3GT的表达,免疫荧光镜检测其细胞表面有明显的Galα（1,3）Gal糖表位表达,转染细胞的增殖能力明显降低,同时促进细胞凋亡。结论：转染α1,3-半乳糖基转移酶基因可明显抑制人肝癌细胞HuH7的恶性生物学行为,具有潜在的临床应用价值。     

小鼠α1,3-半乳糖糖基化修饰对人肝癌HuH7细胞生物学特性的影响

目的:探讨利用小鼠α1,3半乳糖基转移酶基因进行肝癌基因治疗的可行性。方法:将pcDNA3.1-α1,3GT真核表达载体以脂质体介导法转染人肝癌细胞HuH7,经G418压力筛选出稳定表达的阳性克隆,经生长曲线法,平板克隆形成试验,流式细胞仪等试验分析稳定表达株相关生物学特性变化。结果:转染有α1,3GT的HuH7经RT-PCR法检测到有α1,3GT的表达,免疫荧光镜检测其细胞表面有明显的Galα(1,3)Gal糖表位表达,转染细胞的增殖能力明显降低,同时促进细胞凋亡。结论:转染α1,3-半乳糖基转移酶基因可明显抑制人肝癌细胞HuH7的恶性生物学行为,具有潜在的临床应用价值。     

重组泛素连接酶PTB-U-box/RING的构建与表达

目的 构建重组泛素连接酶PTB-U-box、PTB-RING,并克隆进入pFLAG-CMV4真核表达载体,为研究靶向降解受体型酪氨酸激酶IGF-IR,抑制肿瘤细胞生长提供基础.方法 分别设计引物,扩增接头分子IRS-1的PTB结构域以及E3泛素连接酶CHIP的U-box、Cbl的RING结构域,再利用重组PCR,将PT...     

MIIP 对膀胱癌 T24细胞增殖和迁移侵袭能力的抑制作用及其机制

目的：探讨迁移侵袭抑制蛋白（migration invasion inhibitory protein,MIIP）对膀胱癌 T24细胞增殖和迁移侵袭能力的影响及作用机制。方法：设计并合成 MIIP 过表达质粒,并利用脂质体转染方法上调 T24细胞系中 MIIP 的表达。Western blot 及实时定量聚合酶链反应（Real －time PCR）检测过表达 MIIP 的效果,四甲基偶氮唑蓝法（MTT）及平板克隆法观察 MIIP 过表达对 T24细胞增殖能力的影响,划痕及 Transwell 实验检验 MIIP过表达对 T24细胞迁移侵袭能力的影响。Western blot 及 Real －time PCR 检测过表达 MIIP 后其上皮间充质转化（epithelial －mesenchymal transition,EMT）过程相关标志物钙黏蛋白 E（E －cadherin）、钙连蛋白 N（N －cadherin）、转录因子 Snail 蛋白和 mRNA 变化情况。结果：过表达质粒能有效上调 T24细胞系中 MIIP 蛋白及mRNA 的表达,上调 MIIP 表达后 T24细胞增殖能力明显下降,克隆形成能力下降,迁移侵袭能力减弱;上调MIIP 表达后 E －cadherin 表达增加,N －cadherin 及转录因子 Snail 表达减少。结论：过表达 MIIP 可能通过降解转录因子 Snail,从而抑制 EMT 进程降低膀胱癌 T24细胞的增殖及迁移侵袭能力。     

生物化学实验教学的体会

总结了生物化学实验课的教学经验,提倡在实验教学过程中,以学生为主体、教师为主导的教学理念,注重各实验环节的配置,灵活运用多媒体和示教的教学手段.