MAPK信号通路——肝棘球蚴病治疗新靶点

MAPK信号通路可介导多种细胞因子参与炎症、癌症、免疫紊乱和神经退行性疾病等过程,其在肝棘球蚴病发生发展过程中也发挥重要作用。本文回顾了MAPK信号通路的结构及调节过程,重点阐述了肝棘球蚴病中MAPK信号通路的作用,即MAPK信号通路在肝棘球蚴病中存在虫体与宿主的双重激活,参与了疾病的发生、发展过程,并对其治疗产生影响,以MAPK信号通路为靶点的药物治疗有望成为肝棘球蚴病治疗新的策略。     

肝泡型棘球蚴病患者中性粒细胞胞外诱捕网表达及吞噬功能初探

目的 探索肝泡型棘球蚴病(hepatic alveolar echinococcosis,HAE)患者外周血中中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)表达水平及吞噬功能变化,以及其与临床炎性指标和肝生化指标间的相关性。方法 选取2022年8月—2023年6月青海大学附属医院肝胆外科收治的50例HAE患者作为HAE患者组,选择同期在该院体检中心体检的年龄、性别匹配的50例健康志愿者作为健康对照组,采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测两组研究对象外周血中NETs标志物髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)和中性粒细胞弹性酶(neutrophil elastase,NE)水平。同时,采用密度梯度离心法分离两组研究对象外周血中性粒细胞;经佛波酯(phorbol 12-myristate13-acetate,PMA)体外刺激后,采用流式细胞术分别定量检测中性粒细胞胞外释放的MPO和瓜氨酸化组蛋白(citrullinated histone H3,CitH3)水...     

Wnt/β-catenin信号途径抑制Raw264.7分化

目的 了解Wnt/β-catenin信号途径对小鼠单核/巨噬细胞Raw264.7的分化调控.方法 将细胞分为4组:阴性对照组(即空Raw264.7组)、实验对照组(即感染Ad-GFP组)、阳性对照组(即50 ng/mL RANKL诱导组)和实验组(即感染Ad-β-catenin组).分别给予上述4组处理因素后常规细胞培养3、6和9d提取细胞总RNA,荧光定量real-time (RT-PCR)检测核因子受体(RANK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K(Cathepsin K)及金属蛋白酶-9(MMP-9)mRNA的表达,再于同样处理因素培养6d通过酒石酸抗酸性磷酸酶(TRAP)染色观察Raw264.7的分化情况;Western blot检测TRAP、Cathepsin K蛋白的表达.结果 RT-PCR检测Ad-β-catenin组能下调RANK、TRAP、Cathepsin K和MMP-9 mRNA的表达;TRAP染色显示50 ng/mL RANKL诱导组能成功诱导Raw264.7成多核细胞,空白组和Ad-GFP组有个别多核细胞,Ad-β-catenin组为单核细胞;Western blot检测显示Ad-β-catenin组TRAP、Cathepsin K蛋白表达降低(P＜0.05).结论 Wnt/β-catenin信号途径能抑制RAW264.7分化成熟为破骨细胞.     

Wnt3a对小鼠破骨细胞分化调控的影响

目的 探讨Wnt3a对小鼠破骨细胞分化调控的影响.方法 将细胞分为4组:阴性对照组(即空白组)、实验对照组(感染Ad-GFP组)、阳性对照组(50 ng/ml RANKL诱导组)、实验组(感染Ad-Wnt3a组).分别给予处理因素后常规细胞培养6d,通过酒石酸抗酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞的分化成熟情况;Western blot检测TRAP、Cathepsin K蛋白的表达;分别于处理因素后3、6、9d提取细胞总RNA,荧光定量Real time (RT-PCR)检测核因子κB受体(RANK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K(Cathepsin K)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)基因的表达.结果 TRAP染色显示50 ng/mL RANKL诱导组能成功诱导RAW 264.7成多核(核≥10),空白组和Ad-GFP组有少量多核细胞(3≤核≤5),Ad-Wnt3a组为单核有个别双核;Western blot检测显示Ad-Wnt3a组TRAP、Cathepsin K蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P＜ 0.05);RT-PCR检测Ad-Wnt3a组能下调RANK、TRAP、Cathepsin K、MMP-9基因的表达.结论 Wnt3a能抑制RAW264.7分化成成熟的破骨细胞.     

中性粒细胞胞外诱捕网（NET）与肝脏疾病的关系

中性粒细胞通过释放中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化物酶等蛋白酶,形成中性粒细胞胞外诱捕网（NET）,在体内发挥免疫防御作用,并参与多种肝病的炎性反应,但其过度释放会加重肝组织损伤,成为肝脏疾病的危险因素之一。近年来,有研究发现NET的过度释放可促进病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、肝脏缺血再灌注损伤等疾病向肝癌进展,阐明NET作用机制对肝脏疾病的诊断和进展过程具有重要意义。本文主要阐述NET在肝脏疾病中的最新研究进展,为肝脏疾病的诊疗和预防提供新的思路。     

稳定表达HBx的肝前体细胞株的构建及其对增殖的影响

目的 构建稳定表达乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的肝前体细胞株,检测对肝前体细胞增殖,细胞周期及Wnt/β-catemn信号通路的影响.方法 重组质粒pSEB-Flag-HBx与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBx基因的重组逆转录病毒,并感染小鼠肝前体细胞HP14.5,稻瘟菌素(blasticidin)筛选出稳定表达HBx基因的细胞克隆并扩大培养(HP14.5/HBx组),设HP14.5/Rv(空质粒pSEEB-Flag感染组)及空细胞组HP14.5组为对照组.MTS比色法检测各组细胞的增殖活力,流式细胞术检测细胞周期中各时相所占的比例,荧光定量PCR检测cyclin D1和c-myc mRNA的表达量,Western blot法检测HBx、GSK3β、p-GSK3β(ser-9)、β-catenin、cyclin D1以及c-myc等蛋白的表达.结果 RT-PCR和Western blot法检测到HBx基因和蛋白阳性表达,与对照组相比,HP14.5/HBx细胞增殖活力显著增加(P＜0.05);G1细胞比例明显减少(P＜0.05),S期和G2细胞比例显著升高(P＜0.05);cyclin D1和c-myc mRNA的表达量显著升高(P ＜0.05); GSK3β蛋白水平表达无明显变化(P＞0.05),p-GSK3β、β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白的表达水平显著升高(P＜0.05).结论 成功筛选出稳定表达HBx的肝前体细胞株,HBx通过活化Wnt/β-catenin信号途径促进肝前体细胞的增殖.     

全反式维甲酸诱导肝前体细胞向肝细胞分化的研究

目的：探讨全反式维甲酸（All-trans retinoic acid,ATRA）对肝前体细胞分化的影响。方法：取孕14.5 d胎鼠制备肝前体细胞,瞬时转染带白蛋白启动子（Albumin promoter）的荧光素酶报告质粒pALB-Luc,以便实时检测细胞的分化状态。优化ATRA诱导条件,分别于诱导后3、6、9 d收集细胞总RNA,半定量RT-PCR检测分化相关指标的变化。并于诱导后11 d用苏木精-伊红染色法观察细胞形态的改变,PAS染色观察细胞的分化成熟程度。结果：ATRA浓度为1 μmol/L时对肝前体细胞分化诱导作用最强。与对照组相比,随培养时间的延长,ATRA组分化早期指标膜蛋白（Delta like,DLK）、细胞角蛋白（Cytokeratin19,CK19）表达降低更为明显,而甲胎蛋白（Alpha fetal protein,AFP）、白蛋白（Albumin,ALB）表达更为升高。形态学观察细胞体积增大,呈多边形,核浆比率降低,相嵌紧密排列,可见双核细胞。PAS染色阳性率上升。结论：浓度1 μmol/L的ATRA对肝前体细胞分化诱导作用最强,ATRA能诱导肝前体细胞分化为类肝细胞。     

侧脑室注射链脲佐菌素致大鼠脑内胰岛素通路障碍和认知水平降低

 目的：本文旨在研究胰岛素信号通路在阿尔茨海默病（Alzheimer disease,AD）发病中的作用,并探讨其可能的作用机制。方法：于实验第1 d和第3 d侧脑室（intracerebroventricular,ICV）注射链脲佐菌素（streptozotocin,STZ;3 mg/kg）建立大鼠模型。第1次注射后21 d采用Morris水迷宫检测大鼠的学习和记忆水平;采用Western blotting检测胰岛素降解酶（insulin-degrading enzyme,IDE）、糖原合成酶激酶 3β（glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β）、磷酸化糖原合成酶激酶 3β（p-GSK-3β）、tau和磷酸化tau（p-tau）的表达;采用免疫组化检测淀粉样β蛋白（Aβ1-40和Aβ1-42)在大脑皮质的沉积;用real-time RT-PCR法检测胰岛素、胰岛素受体、tau、IDE mRNA的表达。结果：Morris水迷宫结果显示ICV-STZ明显降低大鼠的认知能力(P<0.05);Western blotting结果显示ICV-STZ能降低IDE的表达,增加GSK-3β的活性和tau的磷酸化水平(P<0.05);免疫组化结果显示ICV-STZ处理的大鼠大脑皮质 Aβ1-40和Aβ1-42均明显增加;PCR结果显示ICV-STZ处理的大鼠大脑胰岛素和胰岛素受体的mRNA水平均降低,IDE mRNA的水平亦下降。结论：ICV-STZ通过影响脑内胰岛素通路导致大鼠出现AD样行为学及病理改变,表明胰岛素信号通路在AD发病中可能起到了一定的重要作用。     

HBx诱导小鼠肝前体细胞上皮-间质转化

目的 探讨乙型肝炎病毒x蛋白(HBx)能否诱导肝前体细胞(HPCs)发生上皮-间质转化(EMT).方法 将重组质粒pSEB-Flag-HBX与包装质粒pAmpho共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,包装获得携带HBx基因的重组逆转录病毒,并感染小鼠肝前体细胞HP14.5,经稻瘟菌素(blasticidin)筛选,获得稳定表达HBx的HP14.5细胞.观察其形态变化,通过实时定量PCR(real time-PCR)及Western blot法检测其间质细胞标志物和上皮标志物在mRNA和蛋白水平的表达量,并采用划痕实验检测其细胞迁移能力的变化.结果 HP14.5细胞稳定表达HBx蛋白后细胞由多角形变为长梭形;与对照组相比,神经钙黏素(N-cadherin)、Snail、vimentin的mRNA和蛋白水平表达均升高,具有统计学差异(P＜0.05)而上皮性钙黏素(E-cadherin)、细胞角蛋白18(CK18)的mRNA和蛋白表达量显著降低(P＜0.05;同时其迁移能力显著升高(P＜0.05).结论 HBx能诱导肝前体细胞发生EMT,并增强其迁移能力.