细胞低温生物学研究进展

众所周知,离体的人体细胞、组织和器官在常规方式下不能长期保存。为保持这些离体生命材料的生物学功能，必须采用长期保存措施。而在生物医学研究中．比如细胞动力学、基因、干细胞治疗等，也希望某一阶段细胞能长期保持，以保证有充分的时间进行研究。本文简要讨论目前为止所发现的这些因素以及相应的低温损伤机制和预防措施。其中，包括最著名的Peter Mazur关于低温损伤的两点假定。     

红细胞冻干保存中的渗透性损伤实验研究

红细胞长期保存中保护剂添加、洗涤过程会引入红细胞渗透性损伤.在冻干保存研究中,由于多种保护剂同时使用,保护剂的类型和功能一直是研究的重点,但很少有从渗透性损伤角度分析保存方案合理性的报道.目前相关文献、专利中所用的保护剂总渗透压差别很大,细胞保存后回收率差异也较大.文中用NaCl溶液实验模拟红细胞保存中保护剂添加、洗涤过程.结果表明,选择合适的添加、洗涤方法可以在一定程度上减小渗透损伤.就红细胞而言,1.5Osmol/kg左右是保护剂总渗透压的一个重要阈值,总渗透压低于该阈值时,渗透性损伤较小;高于该阈值时,渗透损伤随着渗透压的增大而迅速增大.所以选择保护剂时,首先应该根据总渗透压来排除渗透压过高的保存方案,否则红细胞在添加和洗涤保护剂时已经损伤很大.该研究对其它细胞长期保存中保护剂的选择也具有参考意义.     

红细胞在保护剂添加和洗涤时的非平衡渗透响应实验研究

在红细胞低温保存或冻干保存中，高浓度保护剂的添加和洗涤会使细胞体积收缩或膨胀，造成溶血损失，但其体积并非单调收缩或膨胀到最后平衡体积，而是要经历更严重的体积变化后再趋于平衡。本研究以NaCl溶液来模拟保护剂的添加与洗涤过程．将38种不同浓度的NaC;溶液，以一步直接法、4步等体积法或4步等摩尔浓度变化法添加到红细胞中，测定其溶血率。若以溶血率10％为标准，红细胞所能承受的最小渗透压在161mOsmol／k附近，而最大渗透压与溶液添加方式有关，等体积添加法效果较好（其值约为5680mOsmol／kg）。研究中还将12％、18％NaCl溶液以4步等体积法加到红细胞中，再用生理盐水以三种方式洗涤，发现等摩尔浓度变化法洗涤效果最好；洗涤后溶血率大大增加，说明很多细胞虽然在保护剂添加时未溶血，但膜脆性已改变，难以恢复到等渗时体积。     

海藻糖和蛋黄在人类精子冻于保存中的保护作用

人类精子冻干保存中损伤除了来自环境溶液对精子生理活性的损伤外，还会来自于冷冻和干燥过程。目前精子冻干保存中保护剂选取基本上都从生理化学角度考虑，目的为抑制精子内酶活性，没有考虑对冷冻和干燥损伤的抑制。大量文献表明蛋黄能减小冷冻对精子的损伤，而二糖（特别是海藻糖）在细胞干燥中具有特殊保护作用。本研究在前人一般使用的精子冻干保护剂中加入海藻糖，或同时加入海藻糖和蛋黄，通过伊红Y染色、低渗膨胀和电镜显微观测实验，比较不同组成的保护剂对精子结构和膜的保护作用。结果表明，通过加入海藻糖修正的保护剂能提高对精子结构的保护效果，当同时加入海藻糖和蛋黄时效果更好。     

不同复温方法对深低温保存兔颈总动脉力学性能的影响

①目的　研究4种不同的复温方法对深低温保存兔颈总动脉力学性能的影响。②方法　深低温保存后的兔颈总动脉,随机分成4组,分别采用4种不同的复温方法复温:37 ℃水浴、空气复温、-20 ℃冰和液氮冰复温,以新鲜血管为对照。并分别测定4 种方法复温后动脉的力学性能,包括轴向和周向弹性模数和断裂应力。③结果　所有冷冻复温后的血管轴向和周向参数及断裂应力均小于新鲜血管(F=2.89~13.38,q=2.45~9.15,P<0.05)。随着降温速率的降低,血管轴向弹性模数和断裂应力等参数基本是增加的。液氮冰中复温的血管,其上述参数最接近新鲜血管。④结论　逐步慢速复温可以改善深低温保存复温后血管的力学性能,液氮冰复温可能是最好的复温方法。     

二甲基亚砜和1,2-丙二醇对深低温保存兔颈总动脉平滑肌细胞的影响

①目的 用二甲基亚砜(Me2SO)和1．2-丙二醇(PROH)深低温保存兔颈总动脉,评价两种保护剂对深低温保存复温后血管平滑肌细胞再生能力和超微结构的影响。②方法 将免颈总动脉用含有1.5mol／L的Me2SO或1．5mol／L PROH的低温保护剂深低温保存，并在冰袋中缓慢复温．新鲜血管作为对照。复温后和新鲜血管的平滑肌细胞进行体外培养，观察平滑肌细胞的再生能力;同时在透射电镜下观察平滑肌细胞的超微结构。③结果 体外培养结果显示，新鲜血管的平滑肌细胞体外培养24h后开始生长．PROH保存血管的平滑肌细胞在培养24～36h后开始生长；Me2SO保存血管的平滑肌细胞体外培养36～48h开始生长．而且再生细胞的数目显著少于前者，生长速度慢。透射电镜下，与新鲜血管的平滑肌细胞相比．PROH或Me2SO冷冻保存后血管的平滑肌细胞的线粒体等细胞器均无显著变化。但是Me2SO保存血管的平滑肌细胞核染色质的电子密度发生显著变化，异染色质的电子密度明显降低，与新鲜或PROH深低温保存血管平滑肌细咆核常染色质的低电子密度和异染色质的高电子密度明显不同。④结论 1.5mol／L PROH能够有效地保持平滑肌细胞的活性．并且对细胞的再生能力没有明显的损伤作用。Me2SO损伤平滑肌细胞的再生能力、同时引起平滑肌细胞核染色质超做结构的变化。     

体外培养后深低温保存兔颈总动脉结构和力学性能

①目的　观察深低温保存后兔颈总动脉内皮细胞存在状态、平滑肌细胞存活与再生能力;观察并分析深低温保存后、体外培养后动脉血管壁的结构变化、血管力学性能变化。②方法　获取兔子的颈总动脉并用含有1.5 mol/L 1,2 丙二醇(PROH)的低温保护剂深低温保存,复温时采用液氮中预冷的冰袋缓慢复温。以新鲜动脉作为对照。体外培养新鲜和冷冻复温后的动脉的平滑肌细胞(SMCs);同时将冷冻复温后的血管组织在体外培养6、12和24 h,以观察血管内皮细胞和SMCs的变化,以及血管壁的完整性(弹力膜或纤维的完整性)和这些血管的力学特性(弹性模量和断裂压力)的变化。③结果　冷冻复温后血管SMCs在体外培养开始生长增殖所需的时间(24~36 h)几乎与新鲜血管相似,生长的速度也相似。冷冻复温后,血管内壁存留有少量的内皮细胞,平滑肌和血管壁结构没有明显变化。但是,血管力学性能显著降低(F=5.325~97.458,q=2.32~12.38,P<0.05、0.01)。冷冻复温后的血管作为完整的组织体外培养后,所有的内皮细胞脱落,部分SMCs出现变性和坏死;弹力纤维和胶原出现不同程度的断裂,力学性能进一步降低(q=2.12~8.76,P<0.05、0.01)。④结论　本研究中应用的方法对于保护血管的SMCs是有效的,但是对于血管内皮细胞效果不好;冷冻复温过程和复温后体外培养     

冻干红细胞复水时体积响应显微观测及复水损伤机理探讨

冻干红细胞复水时造成的细胞损伤是目前红细胞冻干复水后回收率偏低的重要原因,主要表现复水时样品吸水,细胞环境溶液渗透压变化,细胞体积变化剧烈.了解复水时细胞体积响应对于了解冻干细胞复水损伤机理非常重要.本文中利用一种研究冻干细胞复水时体积响应的方法,即在环境扫描电镜下通过调整相对湿度来控制复水速度,显微跟踪观测细胞尺寸变化.结果 表明,在复水初始阶段红细胞厚度和直径先增大后减小,厚度方向变形能力和幅度比径向大.当体积偏移到一定程度时即发生溶血.因此为减小复水时溶血率,应控制复水条件、减小复水时细胞体积变化.     

冷冻干燥法对人精子DNA的影响

目的探讨冷冻干燥法用于人类精子保存的安全性。方法取健康志愿者合格精液40份，平均分为4组，其中3组分别加入不同的冻干保护剂（ETBS；ETBS＋海藻糖：ETBS＋海藻糖＋蛋黄）后给予冷冻干燥处理，在4℃冰箱中保存3周；1组作为新鲜精液对照组。对4组标本分别以原位缺口末端标记（TUNEL）法和彗星试验进行DNA断裂精子百分率检测。结果ETBS、ETBS＋海藻糖、ETBS＋海藻糖＋蛋黄组和新鲜精液组DNA断裂精子百分率以TUNEL法检测，分别为（6．39±1．46）％、（5．75±1．29）％、（5．20±1．38）％、（4．94±1．86）％；以彗星试验检测，分别为（6．48±1．58）％、（5．83±1．48）％、（5．28±1．42）％、（5．12±1．65）％。冷冻干燥保存后的各组与新鲜精液相比较，DNA断裂精子百分率差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论以ETBS或ETBS加海藻糖、蛋黄为保护剂的冷冻干燥法对人精子DNA无明显损伤，可有效地保护人精子的DNA。     

组织工程中生物合成性细胞外基质的研究进展

通过组织工程构建出一种全新组织,移植或植入后替代丢失的或者功能不正常器官和组织.由生物可降解性、相容性细胞外基质为新组织的生长和构建提供支架,并通过多种途径调节、促进和保持细胞的粘附、生长增殖、分化和特异性基因的表达,在新组织的功能中发挥重要的作用.组织攻程细胞外基质的研究在组织发生生物学机制研究、组织器官移植和基因治疗等领域具有重要意义.