类鼻疽伯克霍尔德菌BPSL1549基因敲除株的构建及鉴定

目的 构建类鼻疽菌BPSL1549基因敲除株[BP(△BPSL1549)],建立有效的类鼻疽菌毒力基因敲除平台.方法 设计引物扩增类鼻疽菌BPSL1549基因上下游同源臂,连接至pK18 mobSacB自杀质粒上,通过大肠杆菌S17-1 λpir以接合方式将其转入类鼻疽菌中.利用同源重组原理替换野生株中的BPSL1549基因,经过蔗糖筛选靶标基因敲除株,并采用PCR、Western blot检测方法鉴定敲除株,利用动物模型评价敲除株表型变化.结果 BP(△BPSL1549)菌株与野生株的BPSL1549基因两侧同源臂片段PCR产物相比缺少600 bp,Western blot检测敲除株不表达BPSL1549基因编码蛋白,成功构建类鼻疽菌BPSL1549基因敲除株.动物实验证实敲除株相比野生株毒力显著降低(P＜0.05).结论 利用同源重组原理成功构建类鼻疽菌BPSL1549基因敲除株,完善了类鼻疽菌敲除平台和评价体系.     

类鼻疽杆菌慢性感染BALB/c小鼠模型的建立

目的 建立类鼻疽杆菌(Burkholderia pseudomallei)慢性感染BALB/c小鼠模型并评价其稳定性.方法 采用0.01 mL洗涤后的高、中、低剂量的类鼻疽杆菌液(菌量分别为3.3×104、3.3×103、3.3×102 CFU)滴鼻感染BALB/c小鼠,密切监测42 d,记录小鼠的生存率,探索合适的攻毒剂量.在低剂量细菌(3.3×102 CFU)感染小鼠后21、28、35、42 d,计数小鼠血液、肝脏、脾脏和肺脏的细菌定植量,ELISA检测血清炎性因子TNF-α、IFN-γ的表达和血清类鼻疽杆菌特异性IgG抗体滴度,观察肝脏、脾脏和肺脏等主要器官的病理学改变,评价动物模型的稳定性.结果 低剂量类鼻疽杆菌滴鼻感染BALB/c小鼠后,小鼠42 d生存率为60％.期间小鼠体质量呈下降趋势,血液、肝脏、脾脏和肺脏均有细菌定植,并出现大量炎性细胞浸润、多灶性坏死和脓肿等病理改变;类鼻疽杆菌血清中特异性IgG抗体滴度从感染后21 d起持续增高;实验组小鼠血清炎性因子TNF-α和IFN-γ表达明显高于对照组(P＜0.05).结论 成功建立了稳定的类鼻疽杆菌慢性感染BALB/c小鼠模型.     

类鼻疽杆菌毒素分子BLF1的重组表达及生物学活性

目的 重组、表达类鼻疽杆菌毒素BLF1并研究其生物学活性.方法 运用DNA重组技术,以pGEX为表达系统在大肠杆菌中表达BLF1蛋白;以纯化重组蛋白rBLF1免疫新西兰大白兔,获得抗rBLF1血清,Western blot及ELISA鉴定抗血清;不同浓度rBLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,观察小鼠生存率;A549细胞模型中,通过CCK-8实验研究目的蛋白的细胞毒性效应及抗体阻断作用.结果 从类鼻疽杆菌基因组DNA中PCR得到了BLF1目的基因,连接到pGEX-6p-2质粒,经双酶切及测序表明重组质粒构建成功.GST-BLF1蛋白经诱导表达、酶切纯化得到了相对分子质量为23×103的高纯度rBLF1,免疫家兔抗血清ELISA效价达1∶1 280 000,Western blot鉴定在目的蛋白位置处出现特异印记条带.重组rBLF1蛋白腹腔注射BALB/c小鼠,小鼠死亡率与蛋白剂量呈正相关.rBLF1蛋白能明显杀伤A549细胞,抗体可有效阻断其杀伤作用.结论 成功重组表达了具有生物活性的rBLF1,该蛋白具有明显杀伤A549肿瘤细胞的作用,同时能够导致小鼠死亡但表现出一定耐受性.     

类鼻疽茵通过诱导线粒体自噬促进其胞内存活的研究

目的 探讨类鼻疽菌感染人单核细胞THP-1后诱导线粒体自噬对其胞内存活的影响.方法 类鼻疽菌BPC006感染THP-1细胞后2h,以未感染组作为对照,通过透射电镜和激光共聚焦显微镜观察线粒体结构变化,流式细胞仪检测类鼻疽菌感染后不同时间点线粒体膜电位的变化,全波长酶标仪检测感染后各时间点ATP含量变化;同时,通过Western blot和实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction,Q-PCR)分别检测感染后各时间点线粒体蛋白HSP60、TIM23和线粒体DNA mtCO1的变化,激光共聚焦显微镜观察线粒体与自噬小体共定位的情况;最后,分别通过线粒体自噬诱导剂CCCP和抑制剂Mdivi-1预处理后,检测各感染时间点胞内细菌载量的变化.结果 类鼻疽菌感染THP-1细胞后2h观察到宿主细胞线粒体超微结构受损,线粒体膜电位和ATP含量在各感染时间点均降低(P＜0.01),且呈时间递减趋势,提示类鼻疽菌感染后线粒体结构和功能受损;Western blot检测显示HSP60和TIM23蛋白水平随感染时间延长而减少,同时Q-PCR检测也显示mtCO1基因水平随感染时间延长而减少,免疫荧光分析显示线粒体蛋白TIM23与自噬小体GFP-LC3共定位明显增多(P＜0.01),提示类鼻疽菌感染后诱导了线粒体自噬的发生;使用线粒体自噬诱导剂CCCP以及抑制剂Mdivi-1处理细胞后,与对照组比较,激活线粒体自噬类鼻疽菌胞内细菌载量增多(P＜0.05),而抑制线粒体自噬其胞内细菌载量降低(P＜0.05).结论 类鼻疽菌感染THP-1细胞后引起宿主细胞线粒体结构和功能受损进而诱导线粒体自噬的发生,从而有利于类鼻疽菌的胞内存活.     

脂噬在病原微生物感染中的作用研究进展

自噬是一种维持细胞代谢稳态的机制,与细胞多种内含物降解有着紧密的关系。脂噬作为一种选择性自噬进程,能够有效地识别并分解脂质。一方面脂噬能够调控脂滴代谢,防止脂质沉积;而另一方面某些病原微生物也能够利用脂噬为自身增殖提供必要条件。本文从自噬与脂质相互作用出发,探讨了脂噬对细胞脂质代谢的影响以及脂噬之于某些病原微生物感染的作用机制和意义。