内质网应激对3T3-L1脂肪细胞成纤维细胞生长因子21 mRNA表达的调节作用

目的在m RNA水平探讨内质网应激对3T3-L1脂肪细胞成纤维细胞生长因子21表达的影响。方法利用经典鸡尾酒法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,再用毒胡萝卜内酯分别按照剂量梯度(0、6.25、12.5、25、50和100 nmol/L)和时间梯度(0、1、3、6和12 h)进行处理,实时PCR检测内质网应激相关蛋白C/EBP同源蛋白和葡萄糖调节蛋白78以及成纤维细胞生长因子21 m RNA的表达水平。结果毒胡萝卜内酯能诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞发生内质网应激,促进C/EBP同源蛋白、葡萄糖调节蛋白78和成纤维细胞生长因子21 m RNA水平显著升高,且与毒胡萝卜内酯的剂量和处理时间呈正相关。当用100 nmol/L毒胡萝卜内酯处理6 h后,成纤维细胞生长因子21 m RNA水平显著增高,为对照组的114.55倍(P<0.05)。蛋白激酶C抑制剂钙磷酸蛋白C能阻断由毒胡萝卜内酯诱导的内质网应激,并伴随成纤维细胞生长因子21 m RNA水平的下降。结论内质网应激能上调3T3-L1脂肪细胞成纤维细胞生长因子21 m RNA表达,且可被蛋白激酶C抑制剂钙磷酸蛋白C阻断。     

肿瘤中TGFβ1/Smads信号通路的研究进展

引言转化生长因子β(transforminggrowthfactorβ)是一个多功能的生长因子超家族,其主要作用包括调节细胞增殖和分化,参与胚胎发育调节,促进细胞外基质(ECM)形成和抑制免疫反应等。TGFβ至少有5种异构体(TGFβ1～5),另外激活素(ac tivin)、抑制素(inhibin)、骨形态发生蛋白(bone morphogenesisprotein,BMP)也属于该家族。其中TGFβ1最为常见,几乎参与了所有的病理和生理过程,并与多种临床疾病有着密切的关系[1]。TGFβ1生物学活性的发挥有赖于正常的信号传导途径,TGFβ1首先被细胞表面的受体TβRⅡ识别并结合,使其构象发生改变,然后被另一受体TβRⅠ识别形成三者的复合物。此时,TβRⅡ的胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域可将TβRⅠ的胞内丝氨酸/苏氨酸磷酸化,TβRⅠ被激活,磷酸化的Smad2或Smad3进入细胞核,与Smad4结合,形成复合物,然后再与核内的各类转录因子结合,调控靶基因的转录。I Smad能够阻碍受体介导的Smad4磷酸化,启动受体复合物的泛素化降解,抑制信号传导,从而起到负调控的作用[2]。1TGFβ1/Smads信号...     

FGFR3真核表达载体的构建及其在人白血病细胞系K562中的表达

目的：构建成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）真核表达载体MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN,并检测FGFR3蛋白在人白血病细胞系K562中的表达。方法:通过PCR法获得FGFR3全长基因（fgfr3-WT）和截短失活型的FGFR3（fgfr3-DN）,经双酶切后与真核表达载体MSCV/puro连接,构建MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组表达质粒。经PCR、双酶切及测序鉴定正确后,脂质体介导转染至人白血病细胞系K562中,经puromycin抗性筛选后,Western blotting法和流式细胞术检测细胞中FGFR3蛋白的表达。结果：PCR法鉴定MSCV/puro-fgfr3-WT和MSCV/puro-fgfr3-DN重组质粒,2个质粒分别扩增出2　400 bp的fgfr3-WT全长基因片段和1　200 bp的fgfr3-DN截短型片段,表明成功扩增fgfr3-WT全长基因和1　200 bp的fgfr3-DN基因;双酶切MS
CV/puro-fgfr3-WT重组质粒,获得2　400 bp的目的基因片段;测序显示,fgfr3-WT片段大小为2　400 bp,Blast对比分析表明测序结果与GenBank中的FGFR3序列完全一致。fgfr3-DN片段大小与预先设计的序列完全一致,表明成功构建野生型FGFR3和突变失活型FGFR3真核表达载体;Western blotting 检测,与对照组（K562-MSCV）比较,MSCV/puro-fgfr3-WT转染组（K562-WT）FGFR3蛋白表达水平增加,表达水平是对照组的10倍以上;MSCV/puro-fgfr3-DN转染组（K562-DN）的截短型的FGFR3（K562-DN）高表达,而对照组和K562-WT转染组则无此片段;流式细胞术检测,K562-WT组有57.5%的细胞高表达FGFR3,K562-DN组有41.5%的细胞高表达FGFR3-DN。结论：成功构建高表达野生型和突变型FGFR3的人白血病细胞系K562。     

VEGF与SUMO在大肠杆菌中融合高效表达及纯化

目的研究血管内皮生长因子（VEGF）与小分子泛素样修饰蛋白（SUMO）融合并转入大肠杆菌B121中进行VEGF的可溶性高效表达。方法采用PCR扩增方法,获得编码VEGF与SUMO融合蛋白的DNA片段并插入表达载体pET3c中,构建重组表达载体pET3c—SUMO—VEGF,转化到大肠杆菌BL21中,获得重组菌株BL21／pET3c—SUMO—VEGF。以IPTG为诱导剂,对阳性重组菌株的诱导表达参数如诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间等进行优化。结果融合蛋白的最佳表达条件为当OD600约0．6时,加入0．5mMIPTG,20℃诱导24h,获得了纯度达70％以上的SUMO—VEGF。结论通过融合表达。解决VEGF独立表达时表达量低和可溶性差的问题,使其商业化的步伐进一步加快。     

人成纤维细胞生长因子-21基因的克隆表达及蛋白的纯化

目的：构建和表达人成纤维细胞生长因子-21（FGF21）的基因工程菌,为治疗2型糖尿病的新药开发提供实验数据。方法：通过PCR方法,以质粒pET20b-FGF21为模板扩增FGF21全长,将其与分子伴侣SUMO相融合,再将该融合基因与原核表达载体pET20b连接后转化至BL21（Rosetta）宿主细胞中,通过IPTG诱导获得可溶性表达。将融合蛋白经Ni-NTA、分子筛等进行纯化,获得的蛋白纯度在95%以上。结果：经酶切和基因测序证实获得的FGF21基因序列与GenBank（登录号NM019113）报道的完全一致,构建的pET20b-SUMO-FGF21表达载体在BL21大肠杆菌中成功表达FGF21蛋白,蛋白表达量在15%以上,经SDS-PAGE证实其相对分子质量为19 401,与理论预期值相符。Western blotting 分析该表达产物与人FGF21多克隆抗体具有特异性结合能力,经SUMO酶酶切后获得纯度大于95%以上的纯蛋白。结论：成功构建表达人FGF21融合蛋白的基因工程菌,经IPTG诱导、Ni-NTA、分子筛等进行纯化后获得了FGF21纯蛋白。     

肿瘤中TGFβ1/Smads信号通路的研究进展

引言转化生长因子β(transforminggrowthfactorβ)是一个多功能的生长因子超家族,其主要作用包括调节细胞增殖和分化,参与胚胎发育调节,促进细胞外基质(ECM)形成和抑制免疫反应等。TGFβ至少有5种异构体(TGFβ1～5),另外激活素(ac tivin)、抑制素(inhibin)、骨形态发生蛋白(bone morphogenesisprotein,BMP)也属于该家族。其中TGFβ1最为常见,几乎参与了所有的病理和生理过程,并与多种临床疾病有着密切的关系[1]。TGFβ1生物学活性的发挥有赖于正常的信号传导途径,TGFβ1首先被细胞表面的受体TβRⅡ识别并结合,使其构象发生改变,然后被另一受体TβRⅠ识别形成三者的复合物。此时,TβRⅡ的胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域可将TβRⅠ的胞内丝氨酸/苏氨酸磷酸化,TβRⅠ被激活,磷酸化的Smad2或Smad3进入细胞核,与Smad4结合,形成复合物,然后再与核内的各类转录因子结合,调控靶基因的转录。I Smad能够阻碍受体介导的Smad4磷酸化,启动受体复合物的泛素化降解,抑制信号传导,从而起到负调控的作用[2]。1TGFβ1/Smads信号...     

Smad 4基因在鼻咽癌CNE2细胞中的突变分析

目的:研究CNE2细胞中Smad 4基因的突变.方法:运用RT-PCR方法从CNE2细胞中克隆人Smad 4 cDNA序列,然后与正常鼻咽组织及GenBank序列进行比较分析.结果:CNE2细胞中Smad 4基因没有发生任何形式的突变.结论:CNE2细胞可能是一种非Smad 4突变的恶性肿瘤,构建的含有人Smad 4编码序列的重组质粒,为今后开展Smad 4基因的功能研究奠定了基础.