含结核分枝杆菌ESAT6和CFP10基因的重组腺病毒表达载体的构建

目的克隆结核分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,构建能同时表达两基因的重组腺病毒活载体,为研制能有效防治结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法首先利用PCR技术克隆结核分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,将两者通过IRES串连插入腺病毒转移载体中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10。该穿梭质粒转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAdeasy-1-pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10。PacI酶切线性化该质粒,转染AD293细胞进行病毒包装。结果ESAT-6和CFP-10基因成功克隆,其序列与GenBank公布的一致。两者通过IRES串连插入腺病毒转移载体,获得的重组穿梭质粒经同源重组,成功获得复制缺陷型重组腺病毒质粒Adeasy-1-pShuttle-CMV-ESAT-6-IRES-CFP-10,转染该质粒的AD293细胞出现细胞病变效应。结论成功克隆了分枝杆菌的ESAT-6和CFP-10基因,构建了含IRES串连的ESAT-6和CFP-10基因的重组腺病毒,为重组腺病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。     

用灭活牛白血病病毒特异性防御牛白血病病毒感染和牛白血病的可能性

业已证实,将纯化的牛白血病病毒(BLV)接种新生犊牛,可以人工复制BLV感染和白血病,而采用灭活BLV则能使牛只免受其感染。作者对灭活BLV的条件及获得无逆转录酶活性和无白细胞产生效能但仍具有抗原性的BLV作了研究,并对灭活BLV在4～6月龄绵羊和牛体内的免疫原性和特异性保护力作了探索。     

母牛口服活菌苗或死菌苗后对大肠杆菌菌毛抗原K99的抗体应答

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的菌毛能促使ETEC在肠道中寄居。母体用这种菌毛作肠道外免疫后,能防止其新生的吮乳幼畜发生带有同型菌毛的ETEC引起的致死性下     

牛结核病荧光定量PCR快速检测方法的建立及初步应用

目的建立牛结核病荧光定量PCR快速检测方法。方法根据分枝杆菌的插入序列IS1081设计引物和探针,优化反应条件,建立标准曲线,进行特异性、敏感性、重复性实验,并用所建立的方法对临床样品进行检测。结果该方法的敏感性达到了10个拷贝,且特异性高,重复性好。对30份PPD试验和巢式PCR检测都为阳性的临床样本进行荧光定量PCR检测的结果全部为阳性;而对PPD检测阳性,巢式PCR检测为阴性的15份临床样本进行检测时,2份为阳性;在对2份PPD检测阴性而巢式PCR检测阳性的临床样本的检测结果也为阳性。结论成功建立了牛结核病荧光定量PCR快速检测方法,对临床样品的快速检测和牛结核病的早期诊断具有重要意义。     

昏睡嗜血杆菌抗原的分离及用作预防牛血栓栓塞性脑膜脑炎菌苗

作者从血栓栓塞性脑膜脑淡(TEME)病牛脑中分离HS、43826株,原代培养物贮于-60℃。将细菌培养于有4升肉汤的瓶中,经18小时连续搅拌培养后,收获菌体。外膜复合物(OMC)的制备是将收获的菌体(25g湿重)悬浮于100ml 0.1MPBS中,55℃搅拌30分钟,离心弃菌,上清对蒸馏水透析并冻干,     

用昏睡嗜血杆菌菌苗免疫牛预防实验诱发的血栓栓塞性脑膜脑炎

本文目的为评价昏睡嗜血杆菌(Haemo-philus somnus)菌苗的免疫效果。试验分两组:Ⅰ组16头牛,又分两组,A 组10头牛以加氢氧化铝佐剂的昏睡嗜血杆菌菌苗接种2次,每次肌肉注射2ml,间隔3周。B 组6头作为对照。每次接种前抽血作抗体滴度检查。     

牛分枝杆菌ESAT-6-CFP-10融合基因重组腺病毒载体的构建及表达

目的构建表达牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,为研制能有效防治牛结核病的重组腺病毒活载体疫苗打下基础。方法以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得ESAT-6和CFP-10两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术(SOE)将ESAT-6和CFP-10基因通过(G1y4Ser)3接头连接,得到融合基因。将融合基因T/A克隆后,亚克隆至腺病毒转移载体pShuttle-CMV中,构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-ESAT-6-CFP-10,限制性内切酶消化、菌液PCR、序列分析验证无误后,PmeⅠ酶切,转化含有腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-ESAT-6-CFP-10。PacI酶切线性化的重组质粒pAd-CMV-ES-AT-6-CFP-10转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。PCR、Western blot检测包装病毒的融合基因及其表达情况。结果成功构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒载体,包装病毒用PCR、Western blot检测到包装病毒的融合基因及其表达。结论本研究成功地构建携带牛分枝杆菌的ESAT-6-CFP-10融合基因的重组腺病毒,为下一步在动物体内进行免疫效果研究打下基础。     

神经氨酸酶特异性禽流感疫苗对雏鸡的保护效力

作者用2株自然界的禽流感无毒株[A/鹦鹉/北爱尔兰/73(H7N1)和A/鸭/Alberta/35/76(H1N1)]和1株马流感病毒[A/马/迈阿密/1/63(H3N8)]作为免疫病毒,3株强毒[A/鸡/苏格兰/59(H5N1),A/火鸡/英格兰/63(H7N3)和A/火鸡/爱尔兰/83(H5N8)]作攻击病毒。采用血凝抑制(HI)试验和神经氨酸酶抑制(NI)试验测定实验鸡血清效价。实验分6组:Ⅰ组20只鸡先用H7N1株作鼻内、结膜内和口服免疫。15天后,10只     

犊牛腹泻的被动免疫:用产肠毒素性大肠杆菌 K99抗原和轮状病毒预防接种

与犊牛腹泻有关的肠道病原体有轮状病毒、冠状病毒、产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)和隐孢菌(cryptosporidia)。本研究用 ETECK99纤毛和轮状病毒联合疫苗免疫接种妊娠母牛,用血清学检查及 ETEC 攻击新生犊牛,确定其免疫效果。     

B型流感病毒B/Guangzhou/01/2007株HA基因重组3型腺病毒的构建

目的:构建包含有B型流感病毒B/Guangzhou/01/2007株血凝素(HA)基因的重组3型腺病毒.方法:用PCR方法扩增得到HA基因, 酶切后克隆至3型腺病毒穿梭质粒pSK-CMV, 构建重组穿梭质粒pSK-CMV-HA, 然后在大肠杆菌BJ5183内进行经 Not I和 Eco R V线性化的pSK-CMV-HA和经 Rsr Ⅱ线性化的骨架质粒pBRAdV3△E3的同源重组, AsiS I酶切线性化重组腺病毒质粒pBRAdV3△E3-HA后脂质体法转染HEp-2细胞, 进行病毒包装和增殖后得到重组腺病毒rAdV3△E3-HA, 并且通过病变观察、扫描电镜、 RT-PCR、免疫细胞化学方法对基因组的包装和HA基因的表达进行检测.结果:将HA基因克隆入pSK-CMV获得重组穿梭质粒pSK-CMV-HA, 线性化的pSK-CMV-HA与pBRAdV3△E3同源重组后获得pBRAdV3△E3-HA, 线性化的pBRAdV3△E3-HA转染HEp-2细胞观察到细胞病变和HA基因的表达.结论:成功构建了带有HA基因的重组腺病毒rAdV3△E3-HA, 为B型流感病毒-3型腺病毒二联活苗的研究提供了依据.