RNA干扰技术抑制Her2基因表达对卵巢上皮性癌细胞生物学特性的影响

目的 应用RNA干扰技术,观察稳定转染Her2基因的短发夹状RNA(shRNA)对不同恶性程度的卵巢上皮性癌(卵巢癌)SKOV3和SKOV3.ipl细胞Her2基因表达及细胞生物学特性的影响.方法 将表达Her2的质粒pHer2 shRNA分别转染SKOV3和SKOV3.ipl细胞,经抗性筛选获得稳定转染的细胞系.RT-PCR技术、蛋白印迹法检测转染前后细胞Her2 mRNA和蛋白的表达,体外侵袭实验观察转染前后细胞侵袭能力的改变,裸鼠接种肿瘤细胞观察转染前后细胞成瘤能力的改变.结果 转染前后SKOV3.ipl、SKOV3细胞的Her2 mRNA表达量分别为(99.9±1.3)%和(42.4±2.5)%、(68.0±3.1)%和(40.8±2.0)%.Her2蛋白的表达量分别为(98.2±1.7)%和(40.7±2.1)%、(72.1±3.4)%和(36.4±1.5)%,稳定转染后,两种细胞的Her2基因表达均明显下降,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).稳定转染pHer2 shRNA后,SKOV3.ipl细胞的穿膜细胞数由(36.2±9.7)个下降为(15.7±7.2)个,SKOV3的穿膜细胞数由(7.6±1.1)个下降为(1.8±0.8)个,细胞侵袭能力均显著下降,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).稳定转染pHer2 shRNA后,SKOV3.ip1和SKOV3细胞的成瘤重量分别由(1.55±0.31)g下降为(0.69±0.20)g、(1.14±0.10)g下降为(0.38±0.03)g,两种细胞的成瘤能力均显著下降,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 (1)针对Her2基因的RNA干扰技术可以显著降低卵巢癌细胞Her2基因的表达水平.(2)经RNA干扰作用降低Her2基因表达后,卵巢癌细胞的生物学特性改变,恶性度降低.     

卵巢上皮性癌抗独特型抗体6B11T细胞表位的鉴定

目的 鉴定卵巢上皮性癌(卵巢癌)抗独特型抗体6B11的T细胞表位,探讨其诱导抗卵巢癌细胞免疫的分子基础.方法 利用表位预测和12结合力分析实验筛选6B11的互补决定区(CDR)人白细胞抗原(HLA)A0201结合肽.以负载肽的抗原递呈细胞刺激HLA-A2阳性的自体淋巴细胞,获得特异性细胞毒淋巴细胞(CTL),经51Cr释放实验确定6B11的CTL表位.以6B11特异性CTL为反应细胞、负载肽的树突状细胞为刺激细胞,经细胞增殖实验确定6B11的辅助性T细胞(Th)表位.经细胞因子含量测定和干扰素(IFN)γ分泌细胞频数分析,进一步验证获得的表位.结果 6B11轻链可变区CDR3肽(VL CDR3)诱导的CTL能杀伤靶抗原阳性的卵巢癌细胞,该杀伤作用能被抗人主要组织相容性复合物(MHC)Ⅰ类分子抗体阻断,具有MHC-Ⅰ类分子依赖性,为6B11的CTL表位.6B11重链可变区CDR3肽(VH CDR3)能诱导6B11特异性CTL的增殖,该增殖作用大部分能被抗人MHC-Ⅱ类分子抗体阻断,具有MHC-Ⅱ类分子依赖性,为6B11 Th表位.6B11及其表位联合诱导的CTL与卵巢癌细胞共育后均分泌高水平白细胞介素(IL)2(分别为1630、1503 ng/L)、IFN-γ(分别为5620、5421 ng/L)和低水平IL-4(分别为253、274 ng/L),且存在特异性IFN-γ分泌细胞,细胞频数分别为196个/1 ×106个T细胞和184个/1×106个T细胞.结论 6B11具有模拟卵巢癌抗原的CTL和Th表位,对于抗独特型抗体作为抗肿瘤疫苗应用具有重要的理论和实践价值.     

卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv／鼠HSP70融合蛋白复性条件的研究

目的探讨大肠杆菌表达的卵巢癌抗独特型单链抗体／小鼠热休克蛋白70（6811ScFv／mHSP70）融合蛋白包涵体变性、复性条件,以确定其最佳体外复性条件。方法大肠杆菌表达大量融合蛋白6811ScFv／mHSP70：①比较不同的裂解液（8mol／L尿素和6mol／L盐酸胍）对包涵体的裂解效率及其对复性蛋白活性的影响;②探索序贯稀释方法,以及氧化还原环境和复性液中不同浓度L-精氨酸对蛋白稀释复性的影响;③比较稀释复性和柱。卜复性对融合蛋白复性效率及活性的影响。采用Bradford法测定包涵体裂解液与复性后蛋白浓度。所有复性蛋白活性的检测均采用ELISA方法。结果以包涵体形式表达6811ScFv／mHSP70蛋白：①经6mol／L盐酸胍裂解包涵体的效率远高于8mol/L尿素,但前者复性所得蛋白活性低,6mol／L盐酸胍彻底裂解的包涵体经8mol／L尿素透析后再复性,复性效率显著提高;②序贯稀释方法可提高蛋白复性效率;加入0．5mol／L L-精氨酸可降低稀释复性过程中蛋白聚集物的产生,提高复性效率;加入还原型谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSH）浓度比为1：5时,可提高复性后蛋白活性;③柱上复性可一步完成蛋白的复性和纯化,所得蛋白纯度较高,但复性效率和复性后蛋白活性较稀释复性低。结论本研究建立了6811ScFv／mHSP70融合蛋白的最佳复性条件：包涵体经6mol／L盐酸胍彻底裂解后,再经8mol／L尿素透析,然后进行序贯稀释复性,且复性液中加入0．5mol／L L-精氨酸和GSH：GSSH=1：5以提高复性效率和蛋白活性,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

卵巢癌抗独特型单链抗体 6B11ScFv 与鼠 HSP70 融合蛋白的构建、表达及鉴定

 目的 构建卵巢癌抗独特型单链抗体 6B11ScFv 与小鼠热休克蛋白 70（mHSP70）融合蛋白 6B11ScFv/mHSP70,并初步鉴定其免疫活性。 方法 根据 Genebank 上已发表的 mHSP70 基因序列（NM_010478）合成引物行 PCR 扩增,以扩增所得 mHSP70 基因插入 pET30a（+）-6B11ScFv 质粒后转化入 E.coli DH5α,获得 pET30a（+）-6B11ScFv/mHSP70 重组质粒。将鉴定正确的 pET30a（+）-6B11ScFv/mHSP70 重组质粒转化入 E.coli BL21（DE3）,获得 E.coli BL21（DE3）[pET30a（+）-6B11ScFv/mHSP70]重组菌株。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并行 SDS-PAGE 分析,对表达产物进行复性和 Ni2+-NTA 柱亲和层析纯化后,采用蛋白质印迹法和 ELISA 方法进行鉴定和免疫活性检测。 结果 6B11ScFv/mHSP70 融合基因测序结果基本与理论序列相符。SDS-PAGE 分析显示,重组菌株表达产物相对分子质量与预期相符。复性、亲和层析纯化后的蛋白复性率达 20.9%,蛋白纯度达 95% 以上。蛋白质印迹分析证实 6B11ScFv/mHSP70 融合蛋白相对分子质量为 104 000,ELISA 检测表明其具有 6B11ScFv 和 mHSP70 的免疫 活性。 结论 构建表达的 6B11ScFv/mHSP70 融合蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其体内外抗卵巢癌活性奠定了基础。     

人附睾分泌蛋白4联合CA125在卵巢恶性肿瘤与子宫内膜异位症鉴别诊断中的价值

目的 探讨血清人附睾分泌蛋白4(HE4)联合CA125水平检测在卵巢恶性肿瘤与子宫内膜异位症鉴别诊断中的价值.方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测卵巢子宫内膜异位囊肿(内异症组)46例、卵巢上皮性癌(卵巢癌组)36例、卵巢非内膜异位良性肿瘤(良性肿瘤组)60例和健康妇女(对照组)50例血清中HE4和CA125水平,结果以中位数表示.血清HFA和CA125正常值分别为0～150 pmo/L和0～35 kU/L,单独或联合检测时,其中任一指标高于正常上限即定为阳性.通过制作受试者工作特征(ROC)曲线,以曲线下面积(AUC)反映诊断的准确性;以Mann-Whitney U 检验及相关性分析探讨两项指标单独或联合检测用于诊断卵巢内异症囊肿的价值.结果 (1)HE4水平:内异症、对照、良性肿瘤组妇女血清HE4水平分别为52.4、51.0、50.0 pmoL/L,3组比较,差异无统计学意义(P>0.05),卵巢癌组患者HE4水平为507.5 pmoL/L,与其他3组分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).(2)CA125水平:卵巢癌、内异症、良性肿瘤及对照组妇女血清CA125水平分别为743.0、84.9、15.4、11.5 kU/L,卵巢癌组与其他3组比较,差异均有统计学意义(P<0.05).(3)单项榆测结果:卵巢癌组以内异症组为参照时,HE4和CA125笛单项检测的AUC分别0.933和0.821,其特异度为95%时的敏感度分别为79.6%和49.0%;内异症组以对照组为参照时的AUC为0.453;以良性肿瘤组为参照时的AUC为0.496.(4)联合检测结果:卵巢癌组以内异症组为参照时,HE4联合CA125检测的AUC为0.936,其特异度为95%时的敏感度为81.0%.结论 HE4水平可作为卵巢内异症囊肿的鉴别诊断依据之一,HE4联合CA125水平检测能有效鉴别卵巢内异症囊肿和卵巢恶性肿瘤.     

卵巢组织冷冻移植在肿瘤生殖学中的应用前景及存在问题

随着年轻肿瘤患者发病率和治愈率的提高,患者保存生殖能力的要求越来越迫切。卵巢组织冷冻移植作为女性生殖力保存的一种方法,具有生育力储备大、不受生理周期影响、适用于青春期前的年轻女性患者以及无法进行促排卵治疗的肿瘤患者等优于卵子冷冻和胚胎冷冻的独特优势,在肿瘤生殖学中具有重要的应用前景。但是,目前卵巢冷冻移植在技术和应用上还存在一些客观问题,本文综述了卵巢组织冷冻移中的冷冻复苏、存活检测、肿瘤残留检测、体外培养诱导卵泡发育、体内移植及受精发育等众多技术环节,论述了每一环节的具体技术方法、进展以及影响成败的关键因素和存在的问题。本文为广大医务和科研工作者全面了解卵巢组织冷冻移植在肿瘤生殖学中的应用和进展提供了理论参考。     

卵巢癌抗独特型抗体6B11特异性表位肽在体内诱导抗原特异性体液免疫应答

目的探讨卵巢癌抗独特型抗体6B11表位多肽与诱导免疫应答之间的关系。方法采用化学合成的方法，合成抗独特型抗体6B11轻重链可变区的六条CDR区，分别以三种不同浓度免疫BALB／c小鼠。采用ELISA的方法检测免疫鼠血清，进行体内免疫学功能研究。结果6B11抗独特型抗体的六条CDR肽分别加入佐剂免疫小鼠后，其中有两条肽可以诱导出Ab3，分别为重链的CDR2区和轻链的CDR2区。结论这两条肽作为后选肽有可能是6B11抗独特型抗体特异性的CTL表位。     

卵巢癌单克隆抗体杂交瘤细胞18382的无血清培养研究

目的建立体外无血清培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体的方法，并进行纯化工艺的探讨，为规模化抗体生产奠定基础。方法以卵巢癌单克隆抗体杂交瘤细胞18382为研究对象，通过与常规的有血清培养法比较，研究了无血清培养基H-SFM中杂交瘤细胞的生长特性、抗体分泌效率、活性，用Supper-Spinner搅拌瓶进行了放大培养并用Protein A亲和层析法对无血清培养上清中抗体的纯化工艺进行了探索。结果183B2能够直接适应无血清培养基，不需要驯化；抗体生成约4d达到高峰，抗体产量可达50mg／L／10^6个细胞，无血清培养基中细胞生长及单抗的产量与效价与有血清培养的相比没有明显差别。用1 L Supper-Spinner搅拌瓶无血清放大培养183B2细胞成功，培养上清经Protein A亲和层析纯化，蛋白产率约10mg／L培养上清。结论本研究初步成功探索了卵巢癌单克隆抗体细胞183B2的无血清培养方法和抗体提纯工艺，为进一步大规模抗体生产提供了实验依据。     

抗人卵巢癌COC183B2/抗CD3单链双特异抗体的构建和表达

目的:构建和表达一种可与卵巢癌细胞和淋巴细胞结合的双特异抗体.方法:利用PCR分别扩增抗人CD3单链抗体(single chain variable fragment, ScFv)重链可变区(variable region of the heavy chain, VH)和轻链可变区(variable region of the light chain, VL),重组抗人CD3 ScFv,经测序后将其克隆入有链间连接肽基因序列的载体pALM中,再将抗人卵巢癌COC183B2 ScFv克隆至紧邻链间连接肽前形成COC183B2/抗CD3单链双特异抗体(single-chain bispecific antibody, scBsAb)的重组.最后将COC183B2/抗CD3 scBsAb克隆入表达载体pTMFC中进行表达,同时分别表达抗人卵巢癌单抗COC183B2和抗人CD3单抗的ScFv作为对照组.用ELISA、流式细胞学方法和玫瑰花环实验对scBsAb进行免疫学活性测定.结果:成功构建抗人卵巢癌COC183B2/抗CD3 scBsAb;其表达的蛋白链相对分子质量约60;ELISA结果显示scBsAb可与抗原OC183B2结合,流式细胞学结果显示scBsAb可与抗原CD3结合,花环实验显示scBsAb在体外可引导效应细胞聚集在靶细胞周围.结论:构建和表达抗人卵巢癌COC183B2/抗CD3 scBsAb成功,且具有与抗原OC183B2、CD3结合的免疫学活性.     

玻璃化冷冻保存羊卵巢组织异种移植的实验研究

目的:探讨羊卵巢组织玻璃化冷冻复苏后异种移植的卵泡生长发育情况。方法:取绵羊的卵巢,将卵巢皮质切块,应用玻璃化快速冷冻法保存。羊卵巢组织片复苏后在裸鼠的颈部皮下移植,每只裸鼠移植2块组织,于移植1个月后获取移植物,HE染色观察存活卵泡的情况。结果:共移植组织16块,取材时肉眼可见其中一块组织纤维化萎缩,镜下见此块组织纤维化,移植组织存活率87.5%(14/16)。HE染色观察每只移植小鼠的2块移植物中基本只有1块有可视卵泡。1只鼠未见可视卵泡;1只鼠见1个不典型原始卵泡;1只鼠有2个不典型原始卵泡;余下5只鼠的移植卵巢组织中均可见多个典型的存活卵泡。结论:羊卵巢组织经冷冻复苏后能够成功移植于裸鼠的颈部皮下,大部分卵泡处于良好的存活状态。