重组质粒pEGFP-C3-HCVc的构建及在RBE细胞中的表达

目的构建重组p EGFP-C3-HCVc真核表达载体,并建立稳定表达HCVc基因的肝内胆管癌细胞株RBE-core。方法采用PCR钓取目的基因HCVc,并克隆入p EGFP-C3的多克隆位点,构建p EGFP-C3-HCVc重组质粒。经过双酶切及测序验证后,采用脂质体将p EGFP-C3-HCVc质粒转染到RBE细胞中,经2周G418(200μg/m L)筛选后进行单克隆挑选及扩大培养,建立稳定表达HCVc的胆管癌细胞株RBE-core。采用RT-PCR和Western blot验证HCVc在RBE-core中的表达情况。结果 PCR成功钓取HCVc基因,大小约573 bp,并插入p EGFP-C3载体HindⅢ和Bam HⅠ多克隆位点;双酶切及测序证实目的基因HCVc正确连接到p EGFP-C3的多克隆位点。RT-PCR和Western blot分别在573 bp处和34 KD左右检测到相应的阳性条带。结论成功构建重组质粒p EGFP-C3-HCVc,并在胆管癌细胞RBE中获得稳定表达。     

上调SMYD3对人胆管癌FRH0201细胞中DNMT3B表达及细胞增殖的影响

目的: 研究人胆管癌细胞株FRH0201中SET和MYND结构域含有蛋白3(SET and MYND domain-containing protein 3,SMYD3)过度表达对DNA甲基化转移酶3B(DNA methyltransferase 3B,DNMT3B)表达及细胞增殖能力的影响。方法: 瞬时转染SMYD3真核表达质粒后, RT-PCR检测细胞中DNMT3B mRNA水平的变化;Western blotting检测细胞中DNMT3B蛋白水平的变化;CCK-8检测细胞增殖能力的改变;流式细胞术检测细胞周期的改变。结果: 以未处理组为对照,胆管癌细胞FRH0201在转染pEGFP-C3-SMYD3质粒后,DNMT3B蛋白及mRNA表达均显著上升(P<0.01);细胞的增殖能力显著提高、细胞增殖速度加快(P<0.05);进入G₂/M期的细胞明显增多(P<0.05)。结论: 过度表达SMYD3,可引起细胞中DNMT3B的表达上调并增强细胞增殖能力。     

NF-κB特异性抑制剂PDTC对人肝门部胆管癌细胞增殖及SMYD3表达的影响

研究核转录因子-κB (NF-κB)特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲盐酸对肝门部胆管癌QBC939细胞增殖及组蛋白甲基转移酶表达的影响;【方法】 不同浓度的PDTC作用于QBC939细胞不同时间后,CCK-8测定其对QBC939细胞增殖的抑制率,流式细胞仪观察QBC939细胞的周期变化情况,RT-PCR检测PDTC作用下QBC939细胞中SMYD3 mRNA的表达情况,Western blot法检测QBC939细胞内SMYD3蛋白的表达;【结果】 经PDTC处理的实验组,肿瘤细胞增殖活性明显受到抑制(P < 0.05),呈时间和剂量依赖性;与对照组相比,PDTC作用后QBC939细胞G0/G1期细胞比例上升(P < 0.05),并同时伴有癌细胞内SMYD3 mRNA和蛋白表达的降低(P < 0.01),且呈明显的剂量依赖关系;【结论】 PDTC具有显著抑制肝门部胆管癌QBC939细胞生长的作用,其机制可能与细胞增殖抑制;周期阻滞&#65380;以及NF-κB;SMYD3表达抑制有关;     

丙型肝炎病毒核心蛋白通过活化stat3通路促进肝癌细胞上皮间质转化的研究

目的探讨丙型肝炎病毒核心蛋白（HCVc）对肝癌细胞信号转导子和转录激活子3（stat3）通路及上皮间质转化（EMT）的影响。 方法将含HCVc基因序列的重组质粒pEGFP-N3-HCVc转染人肝癌细胞HepG2,Real-Time PCR和Western blotting检测HCVc、总stat3、磷酸化stat3（p-stat3）及EMT指标蛋白E-cadherin、Vimentin、Snail的表达,划痕实验及Transwell实验检测细胞迁移和侵袭情况。 结果划痕实验及Transwell实验结果显示,过表达HCVc可增强HepG2细胞的迁移和侵袭能力;stat3通路抑制剂AG490处理可抑制HepG2细胞的侵袭能力。RT-PCR和Western blotting结果显示,过表达HCVc后,HepG2细胞中p-stat3、Vimentin及Snail在表达升高,E-cadherin表达下降;AG490处理可下调p-stat3、Vimentin及Snail表达,增强E-cadherin表达。 结论HCVc可活化stat3通路促进肝癌细胞上皮间质转化,增强肝癌细胞的迁移和侵袭能力。     

长链非编码RNA Lnc-DQ在肝癌组织中的表达及对其对SMMC7721细胞干性特征的影响

目的 检测长链非编码RNALnc-DQ在肝癌组织中的表达,探讨其对肝癌SMMC7721细胞干性特征的影响。方法 采用实时定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测Lnc-DQ在30例肝癌组织和癌旁组织中的表达;shRNA干扰下调Lnc-DQ在SMMC7721细胞中的表达,克隆形成和成球培养实验观察其对SMMC7721肿瘤干细胞特征的影响;流式细胞仪检测CD133+细胞亚群的比例。结果 Lnc-DQ在肝癌组织中的相对表达显著高于癌旁组织（3.24±0.34 vs 1.81±0.17）,差异具有统计学意义（P<0.05）。shRNA转染可显著下调Lnc-DQ在SMMC7721细胞中的表达（P<0.05）。实验组细胞（sh-Lnc-DQ）克隆形成数为43.62±5.35,较对照组（sh-NC）显著减少（94.31±5.07）,差异具有统计学意义（P<0.05）。成球培养实验显示sh-Lnc-DQ可显著抑制SMMC7721细胞的成球能力（P<0.05）。实验组细胞CD133+细胞比例显著低于对照组织（2.32%±0.25% vs 9.24%±0.69%）,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论 Lnc-DQ在肝癌中高表达,下调Lnc-DQ的表达能够抑制肝癌SMMC7721细胞的干性功能。     

SET-及MYND-结构域含有蛋白3真核表达载体的构建及对肝门部胆管癌细胞生物学行为的影响

目的 构建SET-及MYND-结构域含有蛋白3(SMYD3)荧光质粒并观察组蛋白甲基转移酶SMYD3对肝门部胆管癌细胞生物学行为的影响.方法 在人源组织中调取并扩增SMYD3基因酶切并连接于pEGFP-C3质粒构建SMYD3荧光质粒pEGFP-C3-SMYD3.利用质粒转染人肝门部胆管癌细胞株FRH0201并检测SMYD3表达改变,利用细胞计数试剂盒(CCK-8)方法及Transwell方法检测过表达SMYD3后细胞生长及迁移能力变化.结果 酶切及测序结果显示SMYD3成功连接入pEGFP-C3载体中,Western blot法结果显示在质粒转染组中SMYD3表达较未转染组升高(73.23±5.60)％,较未转染组及空质粒转染组SMYD3表达水平差异有统计学意义(P＜0.05);CCK-8方法及Transwell方法显示转染组细胞生长速度较未转染组及空白组加快,迁移能力增强,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 SMYD3的过表达促进肝门部胆管癌细胞的增殖及迁移,可能是调控肝门部胆管癌发生发展的因素之一.     

沉默NANOG基因表达对侧群表型肝癌干细胞化疗耐药的影响

目的观察沉默NANOG基因对侧群表型肝癌干细胞化疗耐药的影响,初步探讨提高肝癌化疗效果的新方法。 方法基于侧群（SP）细胞分选法,采用流式细胞术从肝癌细胞Hep3B中分选SP细胞和非侧群（NSP）细胞,通过特异性靶向NANOG基因的siRNA沉默SP细胞中NANOG基因表达,MTT法检测SP细胞对化疗药物阿霉素（DOX）的敏感性,实时荧光定量PCR（real-time PCR）和免疫印迹（Western blotting）检测NANOG和耐药相关基因ABCB1的表达。 结果（1）肝癌细胞Hep3B中分选的SP细胞比例为（13.3±1.8）%。（2）MTT法结果显示DOX处理后SP细胞存活率为（65.3±5.4）%,NSP细胞存活率为（41.2±4.7）%;SP细胞对DOX的耐药性高于NSP细胞（P<0.05）。（3）NANOG和ABCB1 mRNA在SP细胞中的表达水平分别是NSP细胞的4.5、4.0倍;NANOG和ABCB1蛋白在SP细胞中表达水平分别是NSP细胞的4.2、3.6倍,差异均有统计学意义（P<0.05）。（4）RNAi沉默NANOG表达后,siNANOG组SP细胞NANOG、ABCB1的mRNA和蛋白表达水平均较Mock组和siNC组明显下降（P<0.05）,SP细胞对阿霉素DOX的耐药性显著降低（P<0.05）。 结论NANOG基因在维持SP表型肝癌干细胞耐药性起重要作用,沉默NANOG表达后SP细胞耐药性受到抑制,可能与ABCB1表达下调有关。     

丙型肝炎病毒核心蛋白对肝癌细胞stat3通路及细胞周期蛋白cyclin D1的调控作用

[目的]探讨丙型肝炎病毒核心蛋白(HCVc)是否调控肝癌细胞中stat3通路及细胞周期蛋白cyclin D 1的表达,参与肝癌细胞的恶性生物学行为.[方法]将含HCVc基因的真核表达质粒pEGFP-N3-HCVc瞬时转染人肝癌细胞HepG2使HCVc过表达,用siRNA-HCVc敲除HepG2细胞中HCVc的表达,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western blot检测HCVc、总stat3(stat3)、磷酸化stat3(p-stat3)及cyclinD1蛋白的表达;流式细胞术及MTT法检测细胞周期变化及细胞增殖情况.[结果]Western blot结果显示,通过瞬时转染而过表达HCVc的HepG2细胞中,HCVc、p-stat3及cyclinD1的蛋白水平高于空白质粒转染组和未转染组;siRNA-HCVc敲除HCVc表达后,HCVc、p-stat3和cyclin D1蛋白的表达下调;酪氨酸磷酸化抑制剂AG490(JAK2特异性拮抗剂)处理可下调过表达HCVc的HepG2细胞中p-stat3和cyclin D1蛋白的表达.流式细胞术显示过表达HCVc可促进细胞向G2/M期进展.MTT法结果显示过表达HCVc使HepG2细胞增殖能力增加.[结论]HCVc可活化HepG2细胞中stat3通路,调控细胞周期蛋白cyclinD1的表达,促进细胞周期进展及细胞增殖,可能与肝癌的发展有关.     

DNA甲基转移酶1对胆管癌细胞中端粒酶的调控作用

目的 观察丙型肝炎病毒核心蛋白(HCVc)阳性肝内胆管癌细胞中人端粒酶逆转录酶(hTERT)的表达,并探讨DNA甲基转移酶1(DNMT1)对hTERT表达的影响.方法 将HCVc质粒瞬转入肝内胆管癌细胞株RBE,5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷(AZA)处理转染后细胞;Western blot 法及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中hTERT及DNMT1的mRNA及蛋白表达.结果 比较空白对照组,转染HCVc质粒后,RBE细胞株中hTERT及DNMT1的mRNA、蛋白水平分别上调3.457±0.081、1.684±0.020、1.826 ±0.060、2.513±0.119(P＜0.05);AZA处理转染后细胞可逆转hTERT的升高,mRNA和蛋白水平分别下调2.755±0.098、1.491±0.045(P ＜0.05).结论 DNMT1参与HCVc诱导的hTERT表达上调过程.     

DNA甲基转移酶在肿瘤发生预后治疗中的作用

DNA甲基转移酶(DNMT)在多种肿瘤细胞中呈表达上调,异常表达的DNMT通过催化肿瘤抑制基因启动子区域CpG岛甲基化,引起抑癌基因甲基化失活,从而促进正常细胞向肿瘤细胞转化.研究表明,DNMT在消化道肿瘤、乳腺癌、肺癌等肿瘤细胞中呈表达丰度异常,且与肿瘤的发生呈明显相关性,并影响肿瘤预后.药物及靶向干扰可抑制DNMT的活性,可使甲基化的基因去甲基化复活,进而抑制肿瘤细胞生长,促进细胞凋亡.