基于CRISPRi的贝氏柯克斯体dotB基因沉默

目的 更简便快捷地研究贝氏柯克斯体基因功能。方法 基于CRISPRi原理构建携带化脓链球菌dCas9的重组质粒,将靶向贝氏柯克斯体dotB基因的sgRNA序列插入重组质粒中并将质粒经电转化导入贝氏柯克斯体,利用脱水四环素(aTC)诱导dCas9表达以抑制贝氏柯克斯体dotB基因的转录,从而建立基于CRISPRi系统的贝氏柯克斯体基因沉默技术。结果 在aTC诱导下,该CRISPRi系统中dCas9可正常表达,dotB在转录水平和蛋白水平均被抑制,dotB表达抑制后贝氏柯克斯体胞内生长繁殖水平降低。结论成功建立起基于CRISPRi的贝氏柯克斯体的基因沉默技术,为研究贝氏柯克斯体特定基因的生物学功能研究提供了技术支撑。     

基于转录组学与网络药理学探讨心阳片防治慢性心力衰竭的机制

目的基于转录组学与网络药理学探讨心阳片防治慢性心力衰竭（CHF）的关键机制。方法将32 只小 鼠随机分为假手术组、模型组、心阳片组（910 mg·kg-1）、培哚普利组（阳性对照组,0.607 mg·kg-1）。采用主动 脉弓缩窄术（TAC）构建CHF 小鼠模型。造模成功后,按照上述剂量灌胃给药（10 mL·kg-1）,每日1 次,连续给 药8 周。给药结束后,对小鼠行心脏彩超检测,采集左室射血分数（LVEF）及左室短轴缩短率（LVFS）等心功能 指标;采用Masson 染色法观察心脏组织病理形态变化。取小鼠心脏组织提取RNA 进行转录组测序,并对组间 差异基因进行GO 功能及KEGG 通路富集分析。通过TCMSP 平台以及文献检索筛选心阳片的活性成分,利用 SwissTargetPrediction 网站预测活性成分作用靶点。通过Venny 平台对转录组测序得到的交集差异基因与活性成 分作用靶点取交集,获得交集靶点（心阳片治疗CHF 的关键靶点）。利用STRING 平台构建交集靶点蛋白互作 （PPI）网络;通过Cytoscape 3.8.0 软件构建“中药-活性成分-关键靶点网络”网络,筛选出心阳片防治CHF 的 核心靶点,并对核心靶点进行KEGG 通路富集分析;采用qPCR 法检测核心靶点mRNA 表达。结果与假手 术组比较,模型组小鼠的LVEF、LVFS 均显著降低（P＜0.01）,小鼠的心脏体积明显增大,心脏系数显著升高 （P＜0.01）,心脏胶原容积分数明显升高（P＜0.05）。与模型组比较,给药组小鼠的LVEF、LVFS 均显著升高 （P＜0.01）,小鼠的心脏体积明显缩小,心脏系数显著降低（P＜0.01）;心阳片组小鼠的心脏胶原容积分数明显 下降（P＜0.05）,培哚普利组的变化无明显差异（P＞0.05）。共得到心阳片有效成分83 个;假手术组-模型组的 差异基因与模型组-心阳片组差异基因的交集差异基因共有354 个,进一步与心阳片主要活性成分的771 个作 用靶点取交集,共得到21 个交集靶点,即心阳片治疗CHF 的关键靶点。心阳片改善CHF 的核心靶点包括 CCNB1、CCNA2、CDK1、PLK1、TNF、ALOX5、CCND1;KEGG 信号通路主要富集在细胞周期、细胞衰老、 FoxO、AMPK、p53、肥厚型心肌病、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 等。结论心阳片可明显改善CHF 小鼠 的心功能,减轻小鼠心脏的纤维化面积以及肥厚程度,与其多成分、多靶点、多信号通路发挥的协同作用机制 相关。