EIAV减毒疫苗诱导马外周血单个核细胞Th1型细胞因子的转录

目的：探讨马传染性贫血病毒驴白细胞减毒疫苗免疫马后,外周血单个核细胞中Th1型细胞因子转录水平与免疫保护应答的关系,揭示DLV的免疫保护机制。方法：应用分子克隆及实时定量RT-PCR技术,建立了马PBMC中IFNγ-、IL-2、IL-12 mRNA转录水平的定量检测方法,定期观察4组（疫苗免疫组、阴性对照组、强毒株阳性对照组、自然感染组）12匹马外周血PBMC中细胞因子的转录水平及分布特征,同时监测体温变化等指标。疫苗株免疫动物8个月后,用EIAV强毒株攻击,观察攻击前后细胞因子转录水平的变化。结果：DLV免疫马,在免疫后3周外周血PBMC中IFN-γ、IL-2转录量显著高于阴性对照组及自然感染组（P〈0.01）;免疫后用EIAV强毒株攻击,IFNγ-、IL-2和IL-12转录的量明显升高,免疫马获得完全保护;强毒株攻击阳性对照马IFN-γ、IL-2转录量随疾病进展波动,发热期下降。结论：本研究首次证明EIAV减毒疫苗可诱导马外周血PBMC中IFN-γ、IL-2、IL-12基因高效转录,其转录水平与DLV的免疫保护密切相关,此结果在分子水平为阐明DLV的免疫保护机制提供了新的实验依据。     

重组猪戊型肝炎病毒ORF2区主要抗原域的原核表达及鉴定

目的：在大肠杆菌中表达猪戊型肝炎病毒ORF2区主要结构蛋白,并对其进行血清学鉴定。方法：通过RT-PCR技术从一份猪粪中扩增并克隆戊型肝炎病毒主要的结构基因片段,将该片段插入pET-32a表达载体,在原核系统中融合表达蛋白,Western blot和间接ELISA方法分析该蛋白的抗原性。结果：SDS-PAGE分析结果表明,获得45kD的目的蛋白,该重组蛋白可以与HEV阳性血清反应,而不与阴性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性。结论：本研究获得了猪戊型肝炎病毒重组抗原,可与HEV阳性血清产生特异性的结合反应,可以作为诊断用的重组蛋白,为研制敏感、特异的HEV诊断试剂盒,行之有效的HEV基因工程疫苗及为HEV感染的预防和临床治疗提供资料。     

新疆马病毒性动脉炎的血清学调查

为搞清马病毒性动脉炎在新疆昭苏县的流行情况,本实验采用法国进口马病毒性动脉炎间接ELISA诊断试剂盒对来自新疆4个地区的435份马血清样品进行检测结果显示．有2份血清检测为阳性,阳性率为1．26％。其中伊犁种马场,昭苏种马场和哈密伊吾县送检血清均为阴性,巴州和静县检出2份阳性血清。目前该病在我国还没有分离到病毒的相关报道,本次流行病学调查研究,对于该病在我国新疆地区的流行现状具有重要的指导意义。     

EIAV减毒疫苗免疫后马外周血单个核细胞中IFN-γ的转录

目的:探讨马传染性贫血病毒(Equineinfectiousa-nemiavirus,EIAV)驴白细胞减毒疫苗(DLV)免疫马后,外周血单个核细胞(PBMC)中IFN-γmRNA转录水平与免疫保护应答的关系,揭示DLV的免疫保护机制。方法:应用分子克隆及实时定量RT-PCR技术,建立马PBMC中IFN-γmRNA转录水平的定量检测方法,在不同时间点定期观察4组(疫苗免疫组、阴性对照组、强毒株阳性对照组及EIAV自然感染组)12匹马PBMC中IFN-γmRNA的转录水平及分布特征,同时监测体温变化等指标。疫苗株免疫动物8个月后,用EIAV强毒株攻击,观察攻击前后IFN-γmRNA转录水平的变化。结果:疫苗免疫马在免疫期内,PBMC中IFN-γmRNA转录的量显著高于阴性对照组及自然感染组(P<0.01)。免疫后用EIAV强毒株攻击,IFN-γ转录的量继续升高,4匹免疫马均获得完全保护;强毒株阳性对照组IFN-γmRNA转录的量随疾病的进展波动,发热期明显下降。结论:本研究首次证明,EIAV减毒疫苗可诱导马PBMC中IFN-γ基因高效转录,其转录水平与DLV的免疫保护密切相关。此结果在分子水平为阐明DLV的免疫保护机制提供了新的实验依据。     

实时定量PCR检测马传染性贫血病毒载量方法的建立和应用

目的建立实时定量PCR检测血浆病毒载量的方法，对马传染性贫血病毒（equine infectious anemia virus，EIAV）强毒株攻毒马和疫苗免疫攻毒马血浆中病毒载量进行了跟踪检测，探讨病毒载量和临床疾病状态的相关性。方法以EIAV强毒株LN40序列为标准，在gag保守区设计1对引物和Taqman探针，用于实时定量PCR扩增，用含扩增目的基因的体外转录RNA作标准品，获得标准曲线，对扩增样品进行准确定量。强毒株LN40直接攻毒，或者疫苗株DLV免疫马6个月后用强毒株LN40进行攻毒，跟踪检测攻毒马及免疫攻毒马血浆中EIAV载量情况。结果反应在10^1～10^9copies／ml之间具有良好的线性关系，反应的检出下限为10copies／ml。强毒攻毒马出现发热并最终死亡，发热期间马血浆中EIAV载量与体温呈正相关，载量最高达10^7copies／ml。免疫攻毒马未出现发热，其血浆EIAV载量的总体水平低于强毒攻毒马，攻毒后3个月低至10copies／ml以下。结论成功建立了实时定量PCR检测血浆EIAV载量的方法，并证实了用实时荧光定量PER检测EIAV病毒载量的方法来监测动物感染状态具有可行性，为EIAV致病机制研究和弱毒疫苗免疫保护机制的研究提供良好的技术平台。     

H3N8型马流感血凝素核酸疫苗的初步研究

目的研发一种具有良好免疫原性的H3N8型马流感血凝素(hemagglutinin,HA)核酸疫苗。方法根据马A型流感病毒A/Equine/Xinjiang/3/08(H3N8)的HA蛋白序列,经密码子优化后化学合成能够表达相应蛋白的基因片段,并将该片段克隆到核酸疫苗载体pJW4303中,构建带有天然信号肽的H3HA核酸疫苗,命名为H3HA/XJ3-08-wt;进一步对HA基因进行修饰,以人组织纤维蛋白酶原激活剂(human tissue plasminogen activator,tPA)取代H3HA天然信号肽,命名为H3HA/XJ3-08-tPA,或切除部分HA的基因片段使之只表达HA蛋白的胞外域,命名为H3HA/XJ3-08-dTM。用这3种重组质粒分别转染293T细胞,蛋白表达经蛋白质印迹检测得到确认。采用电转录法免疫新西兰白兔。ELISA方法检测免疫后兔血清中抗H3HA抗体滴度,血凝抑制实验(hemagglutination inhibition,HI)检测保护性抗体水平。结果 3种H3HA核酸疫苗均可在293T细胞中高效表达,并能够在新西兰白兔体内诱导产生特异性抗H3HA抗体,HI检测到不同水平的保护性抗体。其中以H3HA/XJ3-08-tPA的免疫原性最强。结论新构建的H3N8型马流感血凝素核酸疫苗具有良好的免疫原性,为此类疫苗的进一步研发奠定了基础。     

马乙型脑炎病毒E蛋白的原核表达及间接ELISA的初步应用

目的原核表达马乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)E蛋白,建立JEV间接ELISA诊断方法。方法根据GenBank(AF315119.1)公布的JEVSA14-14-2株E蛋白基因序列设计一对引物,提取病毒RNA经反转录和RT-PCR扩增获得E蛋白编码基因片段,将该片段插入表达载体pET30a(+),转化BL21(DE3)后经IPTG诱导蛋白表达,Western blot检测活性,以表达的E蛋白为包被抗原建立间接ELISA诊断方法。结果获得约1500bp目的片段,与GenBank上的序列同源性100%,其表达产物相对分子质量约为60000,Western blot结果显示该蛋白可与JEV阳性血清结合,具有免疫反应性。建立了间接ELISA检测方法,对不同省份的340份马血清进行检测,其中154份为阳性。结论原核表达JEV的E蛋白具有良好的免疫活性,建立的间接ELISA诊断方法特异性和灵敏性较好,可用于JEV的现地检测。     

EIAV减毒疫苗诱导的特异性细胞免疫应答

目的：研究马传染性贫血病毒（EIAV）减毒疫苗株接种动物体内诱导的细胞免疫学反应方法：选用健康没有EIAV感染的马，接种EIAV减毒疫苗株DLV，运用流式细胞术检测疫苗株诱导的马外周血单核细胞（PBMC）中CD4和CD8阳性淋巴细胞数量的变化，以及^3H测定特异性淋巴细胞增殖反应和^51Cr释放实验测定淋巴细胞杀伤反应：结果：EIAV减毒疫苗株DLV免疫动物后，能够引起CD8^＋细胞明显增加．免疫马PBMC在EIAV刺激下．引起EIAV特异性淋巴细胞增殖反应（SI≥3），并能检测出EIAV特异性CTL活性，靶细胞杀伤百分率高于30％：结论：EIAV减毒疫苗株DLV免疫动物能够引起特异性EIAV细胞免疫反应，极有可能参与宿主的保护免疫作用。     

痘苗病毒对马属动物细胞的感染性研究

目的研究痘苗病毒天坛株是否能够感染马属动物细胞,并诱导免疫马产生免疫反应。方法首先采用重组绿色荧光蛋白(GFP)的痘苗病毒WR株感染驴胎皮肤细胞(FDD)后,通过流式细胞仪定期检测GFP表达水平(病毒感染率),探索最佳感染时间,进而用重组HIV-1 Gag蛋白的痘苗病毒天坛株感染FDD,通过免疫印记实验确认Gag蛋白在细胞内表达,并且进行胞内染色,通过流式细胞仪监测病毒的复制进程;使用痘苗病毒天坛株空载体接种实验马并监测其诱导的免疫反应。结果痘苗病毒感染FDD使产生病变效应,在其内表达外源蛋白,最佳时间为48h;使实验马产生针对病毒的结合抗体。结论痘苗病毒对FDD易感,痘苗病毒天坛株能使实验马感染,提示痘苗病毒重组EIAV抗原的载体疫苗可用于马体接种免疫。