Mcl-1短发夹RNA在Raw264.7细胞内特异性的筛选

目的:将Mcl-1shRNA转染到Raw264.7细胞内,针对shRNA对小鼠Raw264.7巨噬细胞系中Mcl-1表达的影响,筛选出沉默Mcl-1基因效果最明显的特异性shRNA真核表达质粒。方法:将特异性shRNA经脂质体介导转染小鼠巨噬细胞系Raw264.7;半定量RT-PCR和Western blot分别检测转染24、48 h后Mcl-1 mRNA水平变化和Mcl-1蛋白表达情况,分析对应不同位点的三对特异性shRNA片段对Mcl-1的沉默效果。结果:特异性shRNA片段在24、48 h均能有效降低Mcl-1 mRNA和蛋白水平,沉默效率高于正常组、脂质体组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P0.05);对应不同位点的三对shRNA真核表达质粒,其中Mcl-1 shRNA3对Mcl-1 mRNA和蛋白的抑制作用均最强。结论:RNA干扰技术可有效下调小鼠Raw264.7巨噬细胞系中Mcl-1 mRNA水平,明显下调Mcl-1蛋白表达。成功筛选出了沉默Mcl-1基因效果最明显的特异性shRNA真核表达质粒。     

传统BCG初免IL-12联合Ag85A DNA疫苗加强序贯免疫小鼠效果观察

目的 探讨BCG初次免疫,IL-12联合结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗加强免疫对小鼠的免疫效果。方法 实验小鼠随机分为7组,即PBS阴性对照组、BCG组、pcAg85A组、BCG初免pcAg85A加强免疫组、BCG初免pcAg85A联合IL-12加强免疫组、BCG初免IL-12加强免疫组、以及BCG初免pcDNA3.1加强免疫组。按BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85A DNA加强的免疫程序进行免疫实验,在末次免疫后的4、6、8周通过检测小鼠血清总IgG抗体、特异性淋巴细胞增殖,细胞因子的水平,观测对小鼠的免疫效果。结果 采用BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗加强的免疫策略组的小鼠与其它免疫方式组相比,IgG明显升高(P<0.05)、特异性淋巴细胞明显增殖,加强免疫后IFN-γ水平、IL-2水平、IL-4水平BCG/ Ag85A+IL-12组在3个时间段分别为128.2±20.4、190.2±16.51、244.2±39.14;146.2±17.29、271.6±16.36、419.3±28.12;68.6±6.62、96.6±5.5、117.4±10.71均高于其它各组(P<0.05)。结论 采用BCG初免,细胞因子IL-12联合结核分枝杆菌Ag85A DNA疫苗加强的免疫能明显增强机体体液和细胞免疫,为进一步在动物体内进行保护性效应试验的研究提供了依据。     

Mcl-1信号通路阻断剂对H37Rv感染小鼠巨噬细胞凋亡的影响

目的:探讨Mcl-1信号通路阻断剂在结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠模型中对Mcl-1表达、巨噬细胞凋亡情况及结核分枝杆菌的影响。方法:小鼠腹腔注射H37Rv菌悬液,建立感染小鼠模型,针对Mcl-1的信号通路选用JAK/STAT信号通路阻断剂AG490、MAPK信号通路阻断剂PD98059和PI3K信号通路阻断剂LY294002用腹腔注射方式作用于各组感染小鼠模型,分为H37Rv感染组、AG490处理组、PD98059处理组、LY294002处理组和对照组。通过细胞抗酸染色观察结核分枝杆菌H37Rv感染小鼠腹腔巨噬细胞的动物模型是否建立成功;通过免疫细胞化学检测结核分枝杆菌H37Rv感染巨噬细胞的Mcl-1表达情况,使用流式细胞技术检测各组巨噬细胞的凋亡率,采用结核分枝杆菌菌落计数来判断巨噬细胞凋亡对结核分枝杆菌的清除效果。结果:细胞抗酸染色结果可见感染的巨噬细胞内散在排列的红色短小抗酸结核分枝杆菌。免疫细胞化学结果显示H37Rv感染组、AG490处理组和LY294002处理组中的Mcl-1蛋白为强阳性表达,PD98059处理组中Mcl-1蛋白为弱阳性表达,对照组Mcl-1蛋白为阴性表达。流式细胞术检测发现H37Rv感染组巨噬细胞凋亡率较对照组高,PD98059处理组的凋亡率显著高于各组,差异显著(P0.05)。结核分枝杆菌菌落计数结果显示PD98059处理组对H37Rv菌株抑菌作用最明显。结论:Mcl-1信号通路阻断剂通过抑制JAK/STAT、MAPK和PI3K信号通路增加结核分枝杆菌H37Rv感染巨噬细胞的凋亡率,抑制结核分枝杆菌生长;其中,MAPK信号通路干扰Mcl-1的作用最明显,感染的巨噬细胞凋亡率最高,抑菌作用最强。     

结核分枝杆菌逃逸免疫杀伤机制的研究进展

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)是典型的胞内致病菌,感染机体后主要寄居于宿主巨噬细胞内。巨噬细胞作为机体防御系统的第一道防线,可通过介导和调控自身及其他细胞凋亡而实现其免疫调节、免疫杀伤及清除病原菌的作用。MTB感染机体后可通过多种途径使巨噬细胞不能正常凋亡,借以逃避巨噬细胞的免疫监视及清除,继而在体内衍生繁殖。进一步探讨结核分枝杆菌逃逸宿主细胞的免疫杀伤机制,对宿主细胞抗结核免疫及人们更好地防治结核病具有深远影响。     

国产ACYW135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗儿童12月龄加强免疫安全性和免疫原性的Ⅲ期临床试验

目的 评价一款国产ACYW135群脑膜炎球菌多糖结合疫苗(Group A, C, Y and W135 meningococcal polysaccharide conjugate vaccine, MPCV-ACYW135)儿童12月龄加强免疫的安全性和免疫原性。方法 从已完成3月龄MPCV-ACYW135基础免疫Ⅲ期临床试验的儿童中招募受试者,分为两组于12月龄时接受或不接受加强免疫,观察免疫后30d内不良事件,采集免疫前、免疫后30d和18月龄血清标本,检测A、C、Y和W135群脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis, Nm)抗体;分析不良事件发生率、抗体几何平均滴度(Geometric mean titer, GMT)和阳性率。结果 受试者MPCV-ACYW135加强免疫后30d内总不良事件发生率为41.7%(50/120),无与疫苗接种相关的严重不良事件报告。加强免疫后30d的A、C、Y和W135群Nm抗体GMT(1:)分别为491.03(95%CI:399.85-602.99)、420.37(95%CI:332.65-531.22)、135.07(95%...     

靶向沉默Mcl-1基因对感染不同毒力结核杆菌小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的影响

 目的: 通过RNA干扰技术特异性沉默 Mcl-1 基因,探讨下调 Mcl-1 基因对感染不同毒力结核杆菌小鼠腹腔巨噬细胞凋亡的影响。方法: 分别用制备好的新疆地区流行的优势强毒结核分枝杆菌临床分离株(简称强毒株)、结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv(简称H37Rv)、结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra(简称H37Ra)和卡介苗(BCG)菌悬液感染BALB/c小鼠,再以筛选并构建好的Mcl-1-shRNA作用于感染的小鼠模型,同时设立相应对照组,于作用后1 d、3 d、5 d和7 d提取小鼠腹腔巨噬细胞,应用实时荧光定量PCR和Western blot检测各组小鼠腹腔巨噬细胞中Mcl-1 mRNA和蛋白的表达;应用流式细胞术检测各组巨噬细胞的凋亡水平。结果: 小鼠被不同毒力的结核杆菌感染后其腹腔巨噬细胞中Mcl-1 mRNA和蛋白的表达水平均有不同程度的升高,其中以感染了强毒株和H37Rv的腹腔巨噬细胞升高最为明显(P<0.05);应用RNA干扰技术沉默 Mcl-1 基因后,Mcl-1 mRNA和蛋白的表达水平明显低于对照组(P<0.05);流式细胞术分析显示,下调 Mcl-1 基因的表达可诱导小鼠腹腔巨噬细胞凋亡。结论: 应用Mcl-1-shRNA可有效沉默 Mcl-1 在感染了不同毒力结核杆菌小鼠腹腔巨噬细胞中的表达,并能上调巨噬细胞的凋亡水平。