B淋巴细胞刺激因子基因的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

聚合酶链式反应(PCR)扩增获得了编码BLys(134—285AA)的cDNA片段，该片段以限制性内切酶BglⅡ和HindⅢ双酶切插入pET32a载体。测序表明除(ATA^263→ATG^263)突变并导致了氨基酸(1263M)突变外，其余序列与Genbank报道的序列一致。蛋白表达用异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，SDS—PAGE表明：在33ku处有明显的融合蛋白表达，其表达水平高达总茵体蛋白的50％。点印迹证实融合蛋白能与anti—His6Tag抗体反应。生物学活性研究表明BLys协同丝裂霉素能明显地抑制HeLa细胞的生长。     

分泌型TAT蛋白转导结构域基因通用真核表达载体的构建及表达

目的：构建一个全新的分泌型TAT蛋白转导结构域基因哺乳动物细胞融合表达载体并对融合蛋白的表达进行分析。方法：依照编码TAT—PTD11肽及所引入的BamHⅠ酶识别序列和增强性绿色荧光蛋白N端7个氨基酸的碱基序列合成了3条引物，以egfp基因为模板通过依次3轮PCR扩增得到tat-egfp融合基因，该基因片段以sfiⅠ和HindⅢ双酶切后插入哺乳动物细胞表达载体pSectagA，构建成重组载体pSecTAT-m-egfp，BamHⅠ单酶切后该载体自连，即得到可通用的真核表达载体pSecTAT—m，重组质粒psecTAT-m-egfp转染HEK293细胞，融合蛋白的表达用Western blot分析。结果：酶切及测序证实表达载体pSecTAT—m构建成功，Western blot表明TAT—EGFP融合蛋白在HEK293细胞中获得表达并分泌到细胞培养液中。结论：成功地构建了分泌型TAT蛋白转导结构域基因的哺乳动物细胞融合表达载体，为更充分发挥TAT蛋白转导结构域在蛋白质功能及疾病治疗研究中的应用打下了基础。