GLS/IL-12重组BCG的构建及其对小鼠结核病疗效的研究

目的构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组卡介苗(BCG),并观察其对结核分枝杆菌感染的疗效与机制。方法将分枝杆菌复制子OriM克隆进已含GLS和IL-12的多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中(pZM02),得到穿梭质粒pZM03,以pZM03电转化BCG获得重组BCG。结核分枝杆菌H37Rv感染Balb/c小鼠4周后分别用生理盐水、BCG、pZM03和重组BCG治疗,于第一次治疗后3个月,处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平、血清IL-12和肺、脾组织中GLS表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果重组BCG治疗组肺、脾组织荷菌量比生理盐水组、BCG组和质粒组显著降低。重组BCG组和pZM03组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于BCG组和生理盐水组。重组BCG组血清IL-12水平明显高于生理盐水组,但与pZM03质粒组和BCG载体组无明显差异。用免疫组化检测到小鼠肺及脾组织中GLS的表达。生理盐水和BCG组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛,增生改变不明显;重组BCG病变范围局限,并有大量类上皮细胞、泡沫细胞等细胞出现。结论成功构建携带GLS和IL-12的重组BCG;重组BCG对小鼠结核病有一定免疫治疗作用,系增强宿主Th1型免疫应答和抗菌活性有关。     

GLS/IL-12对黑色素瘤细胞B16的增殖及凋亡的影响

目的:体外检测人GLS活性肽和小鼠IL-12基因的共表达产物对黑色素瘤细胞B16的增殖及凋亡的影响.方法:用脂质体将含GLS活性肽和小鼠IL-12基因的共表达质粒转染黑色素瘤细胞B16并用RT-PCR检测其表达,再用MTT试验、Hoechst33258染色、AO/EB染色和Annexin V-FITC流式细胞分析检测基因表达产物对B16细胞的增殖抑制与促凋亡作用.结果:GLS活性肽和小鼠IL-12基因能在B16细胞中表达,MTT法观察到表达产物对B16有明显的细胞增殖抑制作用,经Hoechst33258染色、AO/EB染色和流式细胞分析观察到细胞核浓缩、深染、细胞膜改变等凋亡特征,凋亡指数明显高于对照组.结论:GLS活性肽和小鼠IL-12基因的共表达产物对黑色素瘤细胞B16具有明显的增殖抑制作用及促凋亡作用.     

重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病免疫治疗效果的评价

目的 评估携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠IL-12基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染的治疗效果,及其与临床抗痨药物疗效的比较.方法 结核分枝杆菌H37Rv感染Balb/c小鼠4周后分别用生理盐水、GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌(重组M.S)、INH PZA和重组M.S INH PZA治疗,于第1次治疗后3个月,处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和INF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-γ分泌水平、肺泡灌洗液SIgA的水平和肺、脾组织中GLS表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况.结果 重组M.s、INH PZA和重组M.s INH PZA治疗组肺、脾组织荷菌量(log CFU/g)比生理盐水组显著降低.重组M.s组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于其它组.重组M.s组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于其它组.各组产生黏膜特异性SIgA明显高于未经感染组.用免疫组化检测到小鼠肺及脾组织中GKS的表达.生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛,正常肺泡结构被破坏;其余组肺组织病变轻且局限.结论 重组M.s对小鼠结核病有一定免疫治疗作用,通过增强宿主Th1型免疫应答和GLS的抗菌活性有关;重组M.S对临床常用的抗结核药有协同作用,为结核病的综合治疗打下实验基础.     

颗粒溶素和白细胞介素12重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病的治疗作用

目的 探讨携带编码人天然颗粒溶素和小鼠白细胞介素12（IL-12）基因质粒（pZM03）的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染的疗效与机制。方法 结核分枝杆菌H37Rv感染Balb／c小鼠4周后，分别用生理盐水、耻垢分枝杆菌、pZM03、重组耻垢分枝杆菌治疗6次，于第1次治疗后3个月处死小鼠，检测器官荷菌量、脾淋巴细胞γ干扰素的分泌水平、血清IL-12和IgG2a分泌水平和肺、脾组织中颗粒溶素表达，同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果 重组耻垢分枝治疗组的肺和脾组织对数荷菌量分别为（4.57±0．28）和（3．47±0．25）CFU／g，比生理盐水组的（5．77±0．12）和（4．66±0．18）CFU／g、载体组的（5．62±0．14）和（4．65±0．26）CFU／g及质粒组的（5．04±0．22）和（4．25±0．48）显著降低；重组耻垢分枝杆菌组和pZM03组经结核菌素纯蛋白衍生物刺激后，1干扰素分泌水平显著高于耻垢分枝杆菌组和生理盐水对照组；重组耻垢分枝杆菌组血清IL-12水平和IgG2a水平显著高于耻垢分枝杆菌组和生理盐水对照组。用免疫组织化学方法检测到小鼠肺及脾组织中颗粒溶素的表达。生理盐水和耻垢分枝杆菌组的肺组织病理改变以渗出为主，病变广泛，增生改变不明显；重组耻垢分枝杆菌组的病变范围局限，并有类上皮细胞和泡沫细胞。治疗组和对照组的脾脏病理改变不明显。结论 携带颗粒溶素和IL-12的重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病有一定的免疫治疗作用，与增强宿主Th1型免疫应答和颗粒溶素的抗菌活性有关。     

重组BCG联合抗痨药物对小鼠结核病治疗作用的实验研究

目的：探讨携带编码人天然颗粒溶素（Granulysin，GLS）和小鼠IL-12基因的重组BCG与抗痨药物对结核分枝杆菌感染的协同治疗效果。方法：将结核分枝杆菌H37Rv感染的BALB／c小鼠40只随机分成4组。感染4周后分别用生理盐水、重组卡介苗（BCG）、INH＋PZA和重组BCG联合INH＋PZA治疗，于第一次治疗后3个月，处死小鼠，检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-7．肺、脾组织中GLS表达，同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况。结果：重组BCG联合INH＋PZA治疗组肺、脾组织荷菌量（10gCFU／g）比重组BCG和INH＋PZA治疗组显著降低；重组BCG和INH＋PZA治疗组肺、脾组织荷菌量比生理盐水组显著降低。重组BCG组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于其它组。重组BCG联合INH＋PZA治疗组和重组BCG组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于生理盐水组。重组BCG组用免疫组化检测到小鼠肺及脾组织中GLS的表达。重组BCG和INH＋PZA组病变轻且局限，生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主，病变广泛。重组BCG联合INH＋PZA治疗组肺组织病变最轻。结论：GLS／IL-12重组BCG对小鼠结核病有一定免疫治疗作用；重组BCG联合临床常用的抗痨药可增强抗结核病的疗效。     

结核分枝杆菌阿拉伯糖基转移酶AftA的原核表达及鉴定

目的构建高效表达菌株,以大量表达结核分枝杆菌AftA蛋白,为后续的抗结核药物的筛选奠定基础。方法采用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出AftA的基因片段,将其插入原核表达质粒PQE30,构建重组质粒PQE30-aftA。将PQE30-aftA转化大肠杆菌,用IPTG诱导目的基因表达。Western-blotting免疫印迹法鉴定后纯化该表达产物。结果经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功构建了重组质粒PQE30-aftA。在大肠杆菌M15中用IPTG诱导表达后,获得了AftA蛋白。蛋白经SDS-PAGE分析约为69.5kD。免疫印迹分析证实目的蛋白与阳性结核病患者抗血清产生特异性反应。结论成功制备出重组的AftA蛋白,为新型抗结核药物的筛选奠定了物质基础。