运用siRNA建立稳定低表达IGF1R基因的肝癌细胞株的实验研究

目的运用siRNA技术在肝癌细胞株中建立稳定低表达人胰岛素样生长因子1类受体(IGF1R)基因的细胞株。方法构建包含封闭IGF1R基因的真核表达载体pSUPER-IGF1R-siRNA,转染SMMC7721和Hep3B细胞,G418筛选表达稳定的细胞株。通过RT-PCR、Western-blot分析与鉴定IGF1R mRNA和蛋白及cyclin D1、cyclinB1蛋白的表达,并绘制细胞生长曲线。结果在SMMC7721和Hep3B细胞中成功建立低表达IGF1R基因的细胞株,其生长明显减慢(P<0.05),且其cyclinD1表达亦明显下降(P<0.05)。结论pSUPER-IGF1R-siRNA能抑制SMMC7721和Hep3B细胞的生长。     

CD90和胰岛素样生长因子1受体在原发性肝癌中的表达

目的 探讨干细胞表面标志物CD90和胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1 R)在肝癌中的表达情况及其与原发性肝癌的关系.方法 应用免疫组化S-P法检测36例原发性肝癌中CD90、IGF1R的表达,并以20例肝脏血管瘤患者的正常肝组织作对照.随访33例患者,Kaplan-Meier法对患者中位生存期和生存率进行分析.结果 原发性肝癌组织CD90、IGF1R蛋白的阳性表达率分别为63.89％( 23/36)、52.78％( 19/36),显著高于正常肝组织(0/20)、5％ (1/20),二者比较差异有统计学意义(P＜0.05).CD90在UICC临床分期Ⅲ、Ⅳ期中阳性表达率(79.17％)比Ⅰ～Ⅱ期(33.33％)明显增高(P＜0.05),低分化组阳性表达率(76.92％)比高中分化组(56.52％)明显增高(P＜0.05).IGF1R在UICC临床分期Ⅲ、Ⅳ期的患者中阳性表达率(70.83％)比Ⅰ～Ⅱ期(16.67％)明显增高(P＜0.05),低分化组阳性表达率(84.62％)比高分化组(37.38％)明显增高(P＜0.05).CD90阳性表达和IGF1R阳性表达呈显著正相关(P ＜0.05).CD90阳性者术后中位生存期为85 d,而阴性者术后中位生存期为505 d(P ＜0.05),IGF1R阳性者术后中位生存期为100d,而阴性者术后中位生存期为408 d(P ＜0.05). 结论 CD90、IGF1R可能与肝癌的发生发展相关.     

hIL-10基因修饰骨髓间充质干细胞对肝移植大鼠排斥反应的影响

目的研究hIL-10基因修饰的骨髓间充质干细胞（mesenehymal stem cell,MSC）对大鼠原位异种肝移植排斥反应的影响及机制。方法利用两套管吻合技术行豚鼠对Wistar大鼠的非协调性异种原位肝移植构建模型,按照构建模型过程中处理方式的不同（生理盐水＋地塞米松、MSC＋地塞米松、hIL-10-MSC＋地塞米松）分为空白对照组、MSC组、hIL-10-MSC组。观察受鼠存活时间、肝功能、术后24h移植肝组织IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18及TNF-α的含量及其mRNA表达。结果与空白对照组、MSC组相比,hIL-10-MSC组大鼠生存时间延长、肝功能好转,细胞因子IL-2、IL-12、IL-15、IL—18、TNF-α表达明显降低,IL-4、IL-10表达显著升高（P〈0．05）。结论hIL-10-MSC对移植肝保护作用可能与其抑制IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、TNF—α细胞因子的表达,促进细胞因子IL-4的表达有关。     

hIL-10基因修饰骨髓间充质干细胞对异种T淋巴细胞增殖的影响及机制研究

目的 研究hIL-10基因修饰的MSCs(骨髓间充质干细胞)对异种混合T淋巴细胞增殖的影响及机制.方法 RT-PCR克隆hIL-10基因并将构建慢病毒hIL-10/pLOX-cwGFPs,然后将慢病毒转导hIL-10入豚鼠MSCs;ELISA测定hIL-10-MSCs培养上清hIL-10含量;CCK-8法检测hIL-10基因修饰的骨髓间充质干细胞对体外混合淋巴细胞培养的影响;ELISA测定其培养上清对外周血单个核细胞分泌IFN-γ的影响.结果 成功构建慢病毒hIL-10/pLOX-cwGFP,hIL-10-MSCs培养上清的IL-10水平明显高于未转染(P<0.05);hIL-10-MSCs能抑制异种T淋巴细胞混合培养的增殖反应(P<0.05);加入IL-2能逆转MSCs的抑制作用(P<0.05);hIL-10-MSCs培养上清组能抑制PHA刺激的PBMC分泌IFN-γ(P<0.05).结论 hIL-10-MSCs对混合异种淋巴细胞培养有显著的抑制作用,能抑制PHA刺激的PBMC分泌IFN-γ.     

豚鼠至大鼠异种肝移植手术操作要点及体会

目的 建立稳定的豚鼠至大鼠的异种肝移植模型.方法 在传统"二袖套"法基础上进行改良,并分预实验和正式试验两组进行手术时间和手术成功率的比较.结果 实验通过改良型二袖套法进行肝移植手术80对,预实验手术25对,成功率68%,正式手术35对,成功率89%,显著高于预实验(P<0.05),而手术时间明显低于预实验(P<0.05).结论 改进的异种肝移植术操作简便,随着手术者经验的提高可明显提高手术成功率,可作为异种肝移植实验可靠的动物模型制作.     

siRNA封闭IGF1R增加人肝癌细胞对丝裂霉素敏感性的研究

目的:探讨人胰岛素样生长因子1类受体(insulin-like growth factor receptor,IGF1R)的短发夹环RNA质粒(pSUPER-siRNA-IGF1R)增加人肝癌细胞株SMMC7721对丝裂霉素诱导细胞凋亡的作用及可能的机制。方法:设计并合成特异性靶向IGF1R的siRNA片段并构建pSUPER-siRNA-IGF1R表达质粒,将其转染SMMC7721细胞,通过G418筛选出稳定株。丝裂霉素处理后,通过CCK-8法检测肝癌细胞对化疗药物敏感性的影响,流式细胞术检测各组细胞凋亡指数,Western印迹检测凋亡相关基因的变化。结果:丝裂霉素诱导细胞凋亡的作用明显增强,凋亡指数明显升高(P<0.05)。实验组野生型p53蛋白,bax蛋白表达比对照组明显上调,而bcl-2蛋白表达明显下降。结论:构建的pSUPER-siRNA-IGF1R具有RNA干扰作用,并能增强丝裂霉素诱导的细胞凋亡。     

骨髓间充质干细胞对异种T淋巴细胞增殖的影响及其机制

目的 研究骨髓间充质干细胞(MSCs)对异种混合T淋巴细胞增殖的影响及其机制.方法 采用密度梯度离心法分离豚鼠MSCs;免疫组织化学法检测MSCs膜表面CD45和CD44的表达;流式细胞术检测MSCs周期;CCK-8法检测和绘制MSCs的生长曲线;观察MSCs和其培养上清对体外异种淋巴细胞混合培养的影响.结果 MSCs膜表面CD45表达阴性、CD44表达阳性;分析MSCs周期显示,MSCs中20%左右处于S期、G2期和M期,其余80%左右均处于G0期和G1期.MSCs和其培养上清均能明显抑制异种T淋巴细胞混合培养的增殖反应(P<0.05),加入白细胞介素2(IL-2)能逆转MSCs的抑制作用(P<0.05).结论 MSCS的鉴定可根据细胞形态.膜表面标志物来确定.MSCS及其培养上清对异种淋巴细胞混合培养的增殖反应有显著的抑制作用.     

hIL-10基因修饰的骨髓间充质干细胞的体外免疫抑制作用

目的研究hlL．10基因修饰的骨髓间充质干细胞（mesenchymalstarecell,MSC）对异种混合T淋巴细胞增殖的影响。方法反转录PCR克隆hlL-10基因并构建慢病毒hlL-10／pLOX—CWgfp,然后将hIL．IO／pLOX—CWgfp转入豚鼠MSC内;ELISA法测定hIL-10基因修饰的MSC（hlL-10-MSC）培养上清液内hIL-10含量;CCK-8法检测hIL-10-MSC和其培养上清液对体外混合淋巴细胞培养的影响。结果hIL-10．MSC培养上清液的hIL-10水平明显高于未转染hIL-10者（P〈0．05）;hIL-10-MSC能抑制异种T淋巴细胞混合培养的增殖反应（P〈0．05）;加入IL-2能逆转MSC的抑制作用（P〈0．05）;hIL-10-MSC培养上清液能抑制异种T淋巴细胞混合培养的增殖反应（P〈0．05）。结论hIL-10-MSC和其培养上清液对混合异种淋巴细胞培养有显著的抑制作用。     

输注转染人IL-10基因的骨髓间充质干细胞延长异种肝移植大鼠存活时间

目的 探讨人白细胞介素10(hlL-10)修饰的豚鼠骨髓间充质干细胞(hIL-10-MSCs)输注对异种肝移植大鼠存活的影响及其可能机制.方法 以携带hIL-10基因的慢病毒(hIL-10/LOX-ewGFP)为载体构建hIL-10-MSCs.以豚鼠为供者,Wistar大鼠为受者,制作非协调性异种原位肝移植模型,将受者随机分成3组,每组60只:空白对照组大鼠术前3天和术后1天各静脉注射生理盐水和地塞米松1次;MSCs组大鼠术前3天和术后1天各静脉注射MSCs和地塞米松1次;hIL-10-MSCs组大鼠术前3天和术后1天各静脉注射hIL-10-MSCs和地塞米松1次.记录供者手术时间、供肝冷缺血时间、受者手术时间、肝上下腔静脉(SVC)吻合时间、无肝期及受者存活时间,测定术后各组受者血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和乳酸脱氢酶(LDH)的含量,酶联免疫吸附试验法测定各组受者移植肝组织中自细胞介素2(IL-2)、IL-4、hIL-10、IL-12、IL-15、IL-18和TGF-β1的含量,逆转录聚合酶链反应法检测各组受者移植肝组织中上述各细胞因子mRNA的表达.结果 hIL-10-MSCs组受者存活时间为(72.0±5.5)h,空白对照组和MSCs组受者的存活时间分别为(29.0±2.2)h和(48.0±4.6)h,前者明显长于后二者,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05).hIL-10-MSCs组移植肝组织中IL-4和TGF-β1mRNA的表达明显高于空白对照组和MSCs组(P<0.05,P<0.05),而IL-2、IL-12、IL-15、IL-18 mRNA的表达明显低于空白对照组和MSCs组(P<0.05,P<0.05),hIL-10-MSCs组肝组织中hIL-10 mRNA的表达明显高于空白对照组和MSCs组.结论 静脉输注hIL-10-MSCs可延长异种肝移植大鼠的存活时间,其机制可能与hIL-10-MSCs抑制IL-2、IL-12、IL-15、IL-18等细胞因子的表达,促进IL-4和TGF-β1的表达有关.     

TGF-β1及p27在原发性胆囊癌中的表达及临床意义

目的　检测TGF β1及 p2 7在原发性胆囊癌中的表达 ,研究其蛋白产物在原发性胆囊癌发生、发展过程中的表达特点及相互关系。方法　应用免疫组化SP法检测 36例原发性胆囊癌中TGF β1及p2 7的表达 ,并以同期2 0例慢性胆囊炎作对照。结果　 36例原发性胆囊癌组织中 2 3例TGF β1基因蛋白产物呈阳性表达 ,表达阳性率为6 3.9% ,高于对照组的 10 .0 % (P<0 .0 5 ) ;17例p2 7蛋白阳性表达 ,表达阳性率为 4 7.2 % ,显著低于对照组的 10 0 %(P<0 .0 5 )。TGF β1在有淋巴结或远处转移及NevinⅣ～Ⅴ期患者中表达阳性率 (均为 79.1% )明显高于无转移及NevinⅠ～Ⅲ期的患者 (均为 33.3% ) ,P<0 .0 5 ;p2 7在高、中分化、无淋巴结或远处转移及NevinⅠ～Ⅲ期的患者中表达阳性率分别为 6 0 .9%、75 .0 %及 75 .0 % ,明显高于低分化、有转移及NevinⅣ～Ⅴ期患者 (2 3.0 %、33.3%及 33.3% ) ,P<0 .0 5。p2 7与TGF β1表达两者呈负相关 (r =- 0 .4 4 73,P<0 .0 5 )。TGF β1阳性患者生存率低于TGF β1阴性患者 ,差异有显著性意义 (P<0 .0 5 ) ;p2 7阳性患者生存率高于 p2 7阴性患者 ,差异有显著性意义 (P <0 .0 5 )。结论　在原发性胆囊癌细胞中TGF β1表达上调 ,p2 7表达下调 ,且在有淋巴结或远处转移及NevinⅣ～Ⅴ期患者