类风湿关节炎患者外周血滤泡辅助性T淋巴细胞百分率的变化及意义

目的 探讨滤泡辅助性T淋巴细胞(Tfh)百分率在类风湿关节炎(RA)患者外周血中的变化及意义.方法 选取该院2016年9-11月收治的RA患者,分为RA活动组与RA稳定组,各35例.另选取同期行健康体检者35例作为健康对照组.用流式细胞术检测受试者外周血CD4+ CXCR5+ ICOS+ Tfh细胞的百分率,分析RA患者外周血Tfh细胞百分率与28个关节疾病活动度评分(DAS28)、抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体及类风湿因子(RF)水平的相关性.结果 RA活动组外周血Tfh细胞百分率[(0.84±0.16)％]明显高于RA稳定组[(0.64±0.15)％]及健康对照组[(0.56±0.14)％],差异均有统计学意义(P＜0.01);且RA稳定组亦高于健康对照组(P＜0.05).RA患者外周血Tfh细胞百分率与DAS28及抗CCP抗体水平均呈明显正相关(r=0.355、0.324,P＜0.01),与RF水平无明显相关性(r=0.205,P＞0.05).结论 外周血中Tfh细胞百分率的增加可能与RA的发生、发展有关.     

类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中糖酵解相关基因的表达

目的: 探讨糖酵解相关基因在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）中的表达及其意义。方法: 选取活动期RA患者19例,稳定期RA患者23例,采用Ficoll法分离PBMC,定量PCR检测糖酵解相关基因表达水平,并与健康对照进行比较。结果：与健康对照相比,活动期RA患者PBMC中糖酵解相关基因丙糖磷酸异构酶（triosephosphate isomerase,TPI）、烯醇化酶（enolase,ENO）、M型丙酮酸激酶（pyruvate kinase muscle,PKM）、单羧酸转运蛋白（monocarboxylic acid transporter member,MCT）表达量均增加(P<0.05),稳定期RA患者4种基因的表达略有升高,但差异无统计学意义。结论：RA患者存在糖酵解相关基因表达的改变。糖酵解反应有可能在RA疾病机制中具有重要的意义。     

嗅鞘细胞上清液对抗过氧化氢诱导的星形胶质细胞损伤的线粒体机制

目的： 研究嗅鞘细胞上清液（olfactory ensheathing cell conditioned medium, OECCM）对星形胶质细胞的保护作用及其线粒体机制。方法： 先用500 μmol/L H₂O₂ 损伤星形胶质细胞20 min;再以50%的OECCM继续培养细胞24 h。MTT法检测星形胶质细胞的活性,Hoechst 33342 染色法和蛋白质印迹法检测细胞凋亡及凋亡相关蛋白caspase-3的表达;用JC-1染色法检测线粒体的膜电位。结果： OECCM能减少H₂O₂诱导的细胞凋亡,减少caspase-3的表达,并且使线粒体膜电位增高。结论： OECCM可以对抗500 μmol/L H₂O₂诱导的星形胶质细胞凋亡,其机制可能与稳定线粒体膜电位有关。     

建立ERIC-PCR技术快速分析不同耐药性鲍曼不动杆菌的同源性

目的建立肠杆菌科基因间重复序列引物PCR技术(ERIC-PCR技术)用于分析亚胺培南耐药和亚胺培南敏感鲍曼不动杆菌同源性,为判断医院内感染发生提供一种简便的新方法。方法收集2018年3-6月江苏大学附属医院重症监护室患者痰液中分离的非重复鲍曼不动杆菌80株,其中包含50株亚胺培南耐药菌株,30株亚胺培南敏感菌株。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA,PCR扩增菌株ERIC序列,Quantity One软件分析不同耐药性菌株电泳条带以判断菌株同源性。结果 50株亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌可分为6种基因型,其中最多的一种基因型有24株;30株亚胺培南敏感的鲍曼不动杆菌可分为20种基因型,其中最多的一种基因型仅有3株。结论该院ICU来源的亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌的基因型较少,提示该菌株可能发生了医院内感染。ERIC-PCR技术简单、方便,可以快速分析鲍曼不动杆菌同源性,适合于在各级医院中推广。     

胶原诱导的关节炎小鼠髓样抑制细胞Arg-1、iNOS的mRNA表达

探讨胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠发病过程中骨髓和脾脏扩增的髓样抑制细胞(myeloidderived suppressor cells,MDSC)产物Arg-1、iNOS的mRNA表达水平。应用牛II型胶原免疫DBA/1J小鼠诱导CIA模型,在第一次免疫后的第45天,采用流式细胞术分选小鼠骨髓和脾脏CD11b+Gr-1+的MDSC(纯度>98%),利用定量RT-PCR技术检测MDSC产物Arg-1、iNOS的mRNA表达水平。结果发现,脾脏中,CIA小鼠MDSC细胞Arg-1mRNA表达低于正常小鼠,而iNOS mRNA表达高于正常小鼠,二者差异均具有统计学意义(P均<0.01)。CIA小鼠的骨髓MDSC细胞Arg-1mRNA表达低于正常小鼠,而iNOS mRNA表达高于正常小鼠,但差异均无统计学意义(P均>0.05)。上述结果提示CIA小鼠骨髓和脾脏中的MDSC可能通过产生高水平的iNOS参与CIA的发病。     

转位分子蛋白对人脑胶质瘤U251细胞增殖的影响

目的 利用相对分子质量为18000的转位分子蛋白(TSPO)的特异性配体1-(2-氯苯基)-N-(1-甲基丙基)-异喹啉-3-氨甲酰(pk11195)研究TSPO对人脑胶质瘤U251增殖的影响及机制,为人脑胶质瘤的治疗寻找新的靶点. 方法 体外常规培养U251细胞,应用100、50、25、12.5、6.25 μmol/L pk11195作用2h后MTT比色法检测细胞的增殖活性,同时设对照组(加入等量溶剂);台盼蓝染色法检测对照组和50、6.25 μmol/L pk11195组细胞死亡率的变化;Hoechst33342染色法和流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blotting和免疫荧光法检测细胞TSPO的表达;2’,7’-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)探针法和GSH试剂盒分别检测细胞内活性氧(ROS)和GSH的水平;曲氟胸苷(JC-1)染色法检测线粒体膜电位;荧光素酶法检测细胞内ATP含量. 结果 MTT检测显示50、25μmol/L pk11195组细胞存活率高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);台盼蓝染色显示50 μmol/L pk11195组细胞死亡率、GSH水平低于对照组和6.25 μmol/L pk11195组,差异有统计学意义(P＜0.05);6.25、50 μmol/L pk11195组细胞凋亡率、TSPO的表达量较对照组降低,且50μmol/L pk11195组低于6.25 μmol/Lpk11195组,差异有统计学意义(P＜0.05);6.25、50 μmol/Lpk11195组ATP的含量高于对照组,且50 μmol/Lpk11195组高于6.25 μmol/L pk11195组,差异有统计学意义(P＜0.05).pk11195组ROS水平较对照组降低,而细胞膜电位增高. 结论 TSPO具有促进U251细胞凋亡、抑制其增殖、类似于抑癌基因的作用.     

纳豆芽孢杆菌发酵米糠提取物的保健功能研究

目的:为深度开发米糠资源,比较纳豆芽孢杆菌发酵米糠(rice bran fermentation,RBF)的上清液与未发酵米糠水提液(water extract of rice bran,RBW)的抗氧化活性及其对双歧杆菌的促生长作用。方法:体外实验法测定RBF和RBW的还原力清除·OH和-·O2及其抑制猪油氧化的能力;模拟体内条件,以光密度为指标考察RBF和RBW对双歧杆菌的促生长作用。结果:RBF和RBW均具有抗氧化活性但RBF具有更大的活性其中RBF对·OH和O-·2清除率IC50分别为3.55mg/ml和23.5mg/ml比RBW分别高0.3倍,10倍。在抑制猪油氧化实验中,RBF与RBW均表现出较强的抗氧化活性,而RBF略强于RBW,与VE相近;RBF与RBW都能促进双歧杆菌的生长,促生长率分别达到65.2%和17.8%;经过胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后,RBF仍有51.6%的促生长率。结论:RBF具有更强的抗氧化活性及对双歧杆菌的促生长作用。     

突变AS3Tα-synuclein基因核输入信号和核输出信号真核载体的构建及表达分析

目的:构建真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES,瞬时转染SH-SY5Y细胞.方法:PCR 扩增法获得含有Sal I和Not I的目的片段A53T-SNCA-NLS、A53T-SNCA-NES,Sal I、Not I双酶切载体pRK5,线性pRK5与目的片段经ligation high连接,酶切、PCR鉴定重组质粒pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES.重组质粒通过Lipofactamine2000转染SH-SY5H细胞,免疫荧光法鉴定瞬转细胞.结果:真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES构建成功,NLS、NES能介导突变基因A53T-SNCA翻译的α-synuclein蛋白在核内表达或胞质表达.结论:基因A53T-SNCA翻译的突变α-synuclein蛋白核内高表达或胞质高表达可能是家族性帕金森氏病发病机制中关键因素之一.     

小鼠髓样抑制细胞体外扩增体系的建立

探讨体外诱导小鼠髓样抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSC)扩增的方法及影响因素。采用不同浓度的细胞因子刺激不同浓度的新鲜骨髓细胞(1×105/ml、2.5×105/ml、5×105/ml),置于37℃、5%CO2培养不同时间(0、2、4d),流式细胞术检测MDSC的比例,并计数MDSC的绝对数。结果发现,三种浓度细胞因子组合刺激组MDSC的比例均显著高于新鲜骨髓组和单独GM-CSF或IL-6刺激组(P<0.05),但三组间未见明显差异;培养4d的MDSC比例亦明显高于培养2d的比例(P<0.05);骨髓细胞浓度为2.5×105/ml组诱导的MDSC比例高于其他两个细胞浓度组(P均<0.05)。本研究成功建立体外扩增MDSC的体系,为研究MDSC在肿瘤、炎症等疾病中的免疫机制奠定了基础。     

突变A53Tα-synuclein基因核输入信号和核输出信号真核载体的构建及表达分析

目的:构建真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES,瞬时转染SH-SY5Y细胞。方法:PCR扩增法获得含有SalI和NotI的目的片段A53T-SNCA-NLS、A53T-SNCA-NES,SalI、NotI双酶切载体pRK5,线性pRK5与目的片段经ligation high连接,酶切、PCR鉴定重组质粒pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES。重组质粒通过Lipofactamine2000转染SH-SY5H细胞,免疫荧光法鉴定瞬转细胞。结果:真核表达载体pRK5-A53T-SNCA-NLS、pRK5-A53T-SNCA-NES构建成功,NLS、NES能介导突变基因A53T-SNCA翻译的α-synuclein蛋白在核内表达或胞质表达。结论:基因A53T-SNCA翻译的突变α-synuclein蛋白核内高表达或胞质高表达可能是家族性帕金森氏病发病机制中关键因素之一。