姜黄素对放线菌素D/TNF-α协同诱导PC12细胞凋亡的保护作用及机制研究

目的:观察中药单体姜黄素对ActD/TNF-α协同诱导PC12细胞凋亡的影响,并探讨其机制。方法:采用MTT法确定实验药物的最佳浓度;Hoechst33258荧光染色法观察PC12细胞的凋亡;JC-1荧光分子探针检测线粒体膜电位;Real Time PCR检测凋亡基因Bcl-2/Bax的表达。结果:ActD/TNF-α协同作用可导致PC12细胞的活力降低(P<0.05);出现核固缩、核碎裂现象的细胞增多,细胞凋亡率增高(P<0.05);细胞线粒体膜电位下降;细胞内抗凋亡基因Bcl-2的表达降低(P<0.05)。经姜黄素(5μmol/L)处理后,PC12细胞的活力增强(P<0.05);细胞核固缩、核碎裂现象减少,细胞凋亡率下降(P<0.05);细胞线粒体膜电位上升;细胞内抗凋亡基因Bcl-2的表达增强(P<0.05)。结论:姜黄素可拮抗ActD/TNF-α引起的PC12细胞凋亡,可能与升高线粒体膜电位,促进抗凋亡基因Bcl-2的表达有关。     

黑视素基因转染给光双极细胞部分恢复MNU诱导的视网膜感光细胞变性小鼠的视觉

 目的： 探索定向转染内源性光感受蛋白黑视素（melanopsin/opsin 4,Opn4）基因进入给光型双极细胞后,视网膜变性小鼠模型中视网膜神经元的光反应以及整体视觉行为的改变。方法：选用由甲基亚硝基脲（N-methyl-N-nitrosourea,MNU）诱导的成年CD1小鼠作为视网膜变性模型。于P0~P1 CD1乳鼠视网膜底注射Grm6-Opn4-GFP质粒,Grm6-GFP作为阴性对照。通过电转进行基因转染。术后5周对基因转染小鼠腹腔注射MNU诱导视网膜感光细胞变性,对照组注射生理盐水,共设计5个实验组：正常对照组（normal）、生理盐水Grm6-Opn4-GFP对照组（NS+melanopsin）、MNU诱导模型Grm6-Opn4-GFP治疗组（MNU+melanopsin）、MNU诱导模型Grm6-GFP对照组（MNU+GFP）和MNU诱导组（MNU）。诱导后连续7 d进行明暗箱测试,统计动物在暗箱中的活动时间比。随后进行视网膜电图（electroretinogram,ERG）测试,计算体现给光双极细胞光反应的b波峰值、潜伏期和反映视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）光反应的明视负波反应（photopic negative response,PhNR）。利用免疫荧光法检测动物视网膜黑视素基因转导效果。结果：黑视素可以被定向转染进入视网膜给光双极细胞。明暗箱实验显示MNU诱导7 d后Grm6-Opn4-GFP转染的CD1小鼠滞留在黑箱的时间显著长于未转染组（P<0.05）,ERG测试显示Grm6-Opn4-GFP转染的CD1小鼠的b波也有明显恢复（P<0.05）。结论：定向转染内源性光感受蛋白黑视素基因进入给光型双极细胞可部分恢复视网膜变性模型动物视觉。     

姜黄素对放线菌素D/TNF-α诱导的PC12细胞和大鼠海马神经元损伤的影响

目的: 探讨姜黄素对放线菌素D(ActD)/TNF-α诱导的PC12细胞和大鼠海马神经元凋亡的影响及其作用机制。方法: 将PC12细胞分为以下6组:对照组、TNF-α组、ActD组、姜黄素组、ActD/TNF-α组和姜黄素+ActD/TNF-α组。各组细胞培养24 h后进行下列处理:倒置荧光显微镜普通光观察各组细胞的形态变化;Annexin V/PI染色流式细胞术检测各组PC12细胞凋亡率; Fluo-3 AM染色流式细胞术测定细胞内Ca²⁺浓度。制备离体大鼠海马脑片,分组处理同PC12细胞,细胞外微电极记录技术观察各组海马脑片CA1区长时程增强(long-term potentiation,LTP)的变化情况。结果: 10 μg/L ActD和50 μg/L TNF-α协同处理可导致PC12细胞明显损伤,而5 μmol/L姜黄素则可以减轻这种损伤作用(P<0.05);ActD/TNF-α可诱导PC12细胞内Ca²⁺浓度升高,姜黄素可以通过降低胞内Ca²⁺浓度而减少ActD/TNF-α引起的细胞凋亡(P<0.05)。此外,LTP实验也证实ActD/TNF-α可以显著抑制大鼠海马脑片LTP的诱发,而姜黄素可以拮抗这种抑制作用,改善神经元突触可塑性(P<0.05)。结论: 姜黄素可以改善ActD/TNF-α引起的神经元损伤,其机制可能是通过降低细胞内Ca²⁺浓度,维持胞内钙稳态而发挥作用。