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1.
目的 构建携带人肿瘤坏死因子受体Ⅰ胞外区和IgGFc融合基因的重组腺病毒载体(Ad-TNFRⅠ-IgGFc),体外转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),探讨转TNFRⅠ-IgGFc基因的BMSCs治疗类风湿关节炎的可行性.方法 将TNFR Ⅰ-IgGFc基因插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒pBHGlox△E1,3Cre共转染HEK293细胞,重组产生Ad-TNFRⅠ-IgGFc,PCR鉴定毒种正确后,进行扩增、纯化和滴度测定,转染培养至第2代BMSCs,利用RT-PCR、原位杂交、免疫组化方法,检测转染后细胞中TNFRⅠ-IgGFc的转录和表达.结果 成功构建了Ad-TNFRⅠ-IgGFc,感染性滴度达3×1010 TCID50/mL,转染后BMSCs在mRNA和蛋白水平均有TNFRⅠ-IgGFc表达.结论 构建的Ad-TNFRⅠ-IgGFc可有效转染BMSCs,并在其中高效表达,为将表达TNFRⅠ-IgGFc基因的BMSCs用于类风湿关节炎治疗的实验研究提供了基础. 相似文献
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目的 构建人肝细胞生长因子(HGF)重组腺病毒表达载体,体外转染兔骨髓基质干细胞(BMSCs),检测HGF基因表达,探讨转HGF基因的BMSCs治疗股骨头缺血性坏死(ANFH)的可行性.方法 利用RT-PCR方法,从共表达人HGF-Met的NIH3T3-H0细胞株中扩增人HGF cDNA,插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒共转染HEK293细胞,重组产生重组腺病毒Ad-HGF,PCR鉴定毒种正确后,在293细胞中扩增、纯化,TCID50法测定感染性滴度,然后感染BMSCs,RT-PCR、原位杂交、免疫组化检测转染后细胞中HGF的转录和表达.结果 成功制备了Ad-HGF,感染性滴度为2.6×1010TCID50/ml,转染后的BMSCs在mRNA和蛋白水平均有HGF表达.结论 获得高表达人HGF基因的BMSCs,为其用于早期ANFH的治疗奠定了基础. 相似文献
3.
鼻咽癌细胞株体外诱导同种异体T细胞TCR VβCDR3谱型和细胞毒性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 用鼻咽癌细胞株CNE2体外负载同种异体树突状细胞(dendritic cell,DC)诱导T淋巴细胞,使之活化为细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic Tlymphocyte,CTL),观察其体外特异性杀伤和克隆性增殖.方法 用GM-CSF,IL-4和TNF-α体外诱导健康志愿者外周血单核细胞,用CNE2负载,使之分化为成熟DC,流式细胞仪检测负载前后DC的表型特征.在IL-2的作用下,用负载CNE2抗原的DC诱导自身T细胞生成特异性CTL.乳酸脱氢酶释放法检测其特异性杀伤活性;采用免疫谱型分析技术分析T细胞的克隆性.结果 健康志愿者外周血单核细胞体外在GM-CSF,IL-4和TNF-α诱导下获得具有典型表型特征的成熟DC,其诱导的CTL对CNE2有明显的特异性杀伤作用;PBMC的TCR Vβ CDR3谱型呈高斯分布,而诱导后的T细胞部分家族出现优势表达.结论 负载鼻咽癌抗原的同种异体DC所诱导的CTL在体外对鼻咽癌细胞有特异性杀伤作用,优势表达的TCR Vβ CDR3家族对鼻咽癌治疗有潜在的临床应用价值. 相似文献
4.
目的应用斑点ELISA研究卵黄抗体的理化性质,使多克隆抗体的性质得以确定,为今后更好地研究和利用该抗体奠定基础。方法将制备的卵黄抗体用不同的方法(加热、酸、碱、酶等)处理后,再用斑点ELISA检测卵黄抗体的剩余活性。结果IgY有很好的耐热性,巴氏消毒不会使IgY失活。卵黄抗体在pH>5和<9的环境下,37℃3h后仍保持部分活性。卵黄抗体在室温存放4个月后仍保持部分活性。在pH<5时,胃蛋白酶能发挥作用,使卵黄抗体失去活性。结论IgY的高度稳定性,使得这一多克隆抗体的保存和运输较方便,有利于IgY的推广和使用。 相似文献
5.
目的:探讨血清1型腺相关病毒(rAAV1)介导增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因体内、外转染大鼠角膜基质细胞后绿色荧光蛋白(GFP)的表达及转染率。方法:采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清1型腺相关病毒(rAAV1-EGFP)感染原代培养的SD大鼠角膜基质细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP的表达及阳性率。建立大鼠异体角膜移植模型,用含rAAV1-EGFP转染液的培养基在37℃孵育SD大鼠角膜植片同时浸泡缝线18h,再用此缝线间断缝合,将植片移植到大鼠角膜植床,术后通过荧光体视镜观察Wistar大鼠角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况。结果:按rAAV1-EGFP不同转染倍数(MOI)转染角膜基质细胞。转染后3d,在倒置荧光显微镜下观察到角膜基质细胞的细胞质有GFP阳性表达。体视荧光显微镜观察到大鼠角膜中开始有GFP阳性表达;随MOI值的增高而增强,转染后7~9d达到高峰,此时检测rAAV1-EGFP对角膜基质细胞的转染效率,MOI=103时是16.3%,MOI=104时是30.3%,MOI=105时是43.6%,MOI=106时是47.5%。rAAV1-EGFP在大鼠角膜中的表达也明显增强。结论:rAAV1-EGFP可以在体内外稳定、有效转染大鼠角膜基质细胞,是角膜基质细胞理想的报告基因。 相似文献
6.
Jurkat细胞TCR基因重排对 BV CDR3的影响 总被引:2,自引:0,他引:2
目的探讨Jurkat细胞TCRBD2-BJ2基因重排对TCRβ链可变区互补决定区3(BV CDR3)可能产生的影响,为深入研究TCR基因重排奠定实验基础。方法RT-PCR扩增TCR BV26个亚家族CDR3区,结合TCR基因扫描(GeneScan)和基因测序技术,监测Jurkat细胞在增殖传代过程中以及在T细胞激活剂和超抗原SEA等刺激诱导后TCR BV CDR3谱系漂移及长度和序列变化。结果表达TCR BV8家族的单克隆细胞株Jurkat,在增殖传代过程中,以及经刺激诱导48或72h后,未监测到有TCR BV8以外的新的BV亚家族出现,BV8 CDR3长度和一级核苷酸序列也未发生变化。结论Jurkat细胞发生的TCR基因重排可能不引起TCR BV CDR3改变,因而对TCR BV CDR3区抗原识别特异性(即抗原特异性漂移)并未产生影响,但并不排除TCR发生改变的可能性。 相似文献
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系统性红斑狼疮患者外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移和序列鉴定 总被引:1,自引:2,他引:1
目的 探讨系统性红斑狼疮(SLE)患者外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系漂移,为SLE的免疫应答机制和个性化治疗研究提供基础。方法 采用免疫扫描谱型分析技术,分析5例正常献血员的CDR3分布特征及5例SLE患者PBMC中T细胞TCRβ链CDR3的优势利用情况,对克隆性增生T细胞的CDR3区进行序列分析。结果 5例正常献血员PBMC TCR BV CDR3谱型均呈高斯分布,5例活动型SLE患者24TCR BV CDR3家族均出现不同的优势表达。对单/寡克隆性增生T细胞B链CDR3区基因进行测序,证实存在不同的CDR3序列。结论 SLE活动期外周血T细胞TCRβ链CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达可能与SLE的免疫发病机理有关。特异应答的T细胞TCRCDR3序列的确定,将为SLE的发病机制研究和个性化治疗提供新的方法与手段。 相似文献
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监测TCR CDR3漂移的免疫扫描谱型分析技术的建立与鉴定 总被引:7,自引:0,他引:7
外周血95% T淋巴细胞的TCR由α(胚系基因中AV、AJ、AC重排)、β(胚系基因中的BV、BD、BJ、BC重排)两条多肽链组成,不同V(D)J重排后,由V基因末端、J基因前端和V-J(或V—D和D—J)连接时中间插入的核苷酸序列,分别组成了特异的TCRα和8的CDR3基因谱型的多样性。一种CDR3序列代表一个T细胞克隆,测定特定CDR3序列出现的频率可以反映特定T细胞克隆扩增的程度和功能状态。 相似文献
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马骊;周明乾;罗微;温茜;黄永塔;王小宁 《广东医学》2008,29(8)
[摘要] 目的 探讨活动性肺结核患者外周血T细胞TCR α、 链CDR3 谱系漂移,为肺结核患者特异性T细胞免疫应答机制和免疫治疗研究提供基础。方法 采用基因扫描谱型分析技术,分析6例正常献血员及6例活动性肺结核患者PBMC中T细胞TCR CDR3谱型分布特征及患者TCR Vα和Vβ基因家族的优势取用情况,对克隆性增生T 细胞CDR3区进行序列分析。结果 6例正常献血员外周血中TCR 32 Vα、24 Vβ家族CDR3谱型均呈高斯分布(gaussian distribution),6例活动性肺结核患者出现不同Vα和Vβ家族优势取用,对部分单/寡克隆增生T细胞α、 链CDR3区基因进行测序,证实存在不同的CDR3序列。结论 肺结核患者活动期外周血T细胞TCR α、 链CDR3谱系出现明显漂移,提示CDR3的选择性表达与结核患者细胞免疫应答机制有关,优势取用Vα、Vβ家族T细胞TCR CDR3序列的确定,为肺结核患者特异性T细胞免疫治疗研究提供基础。 相似文献
10.
目的 构建携带人可溶性肿瘤坏死因子受体I胞外区和IgGFc融合基因的重组腺病毒载体(Ad-sTNFRI-IgGFc),体外转染正常人气道上皮细胞株(HBE135-E6E7),探讨重组腺病毒Ad-sTNFRI-IgGFc转染气道上皮治疗支气管哮喘的可行性.方法 将sTNFRI-IgGFc基因插入腺病毒穿梭质粒pDC316,与辅助质粒pBHGlox△E1,3Crc共转染HEK293细胞,重组产生Ad-sTNFRI-IgGFc,PCR鉴定毒种正确后,进行扩增、纯化和滴度测定,转染培养HBE135-E6E7,流式细胞术检测转染效率,RT-PCR、免疫组化检测转染后细胞中sTNFRI-IgGFc的表达和转录.结果 成功构建了Ad-sTNFRI-IgGFc,感染性滴度达3×1010TCID50/ml,转染后HBE135-E6E7在mRNA和蛋白水平均有sTNFRI-IgGFc表达.结论 构建的Ad-sTNFRI-IgGFc可有效转染HBE135-E6E7,并在其中高效表达,并能拈抗TNF活性,为将表达sTNFRI-IgGFc腺病毒基因治疗哮喘的实验研究提供了基础. 相似文献