日本血吸虫磷酸丙糖异构酶编码基因的克隆与序列测定

目的克隆和鉴定日本血吸虫磷酸丙糖异构酶(SjTPI)编码基因,为寻找血吸虫病的候选疫苗联合应用打基础.方法设计合成引物,抽提日本血吸虫成虫总RNA,用RT-PCR法从中扩增出SjTPI基因编码序列,将其克隆入pGEM-T载体,用双酶切、以重组质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定.结果 RT-PCR法从成虫总RNA中扩增出大小为759 bp SjTPI基因编码序列,重组质粒pGEM-SjTPI经双酶切、PCR扩增,均可获得一条与RT-PCR产物一致的DNA片段,序列测定结果表明具有一个长度为759 bp的完整开放阅读框,与日本血吸虫(菲律宾株)和曼氏血吸虫磷酸丙糖异构酶核苷酸序列有高度同源性(分别为99%和88%).结论该实验成功地克隆了SjTPI编码基因,为进一步研究提供了条件.     

巴西累西腓地区伊维菌素治疗班氏丝虫病的观察

为了详细地了解伊维菌素治疗淋巴丝虫病中虫体死亡动力学和药物所致的副反应,作者在巴西累西腓地区选择了43例年龄在18—46岁无症状的班氏微丝蚴血症患者,微丝蚴计数为105条—6030条/ml(中位数为1106条);通过双盲法将其分为4组,各组病人血中微丝蚴几何均数分别为每ml中511条,579条,612条和588条,组间无明显差     

日本血吸虫钙网蛋白基因的克隆、表达及鉴定

目的 为了寻找日本血吸虫病新的免疫学候选分子,克隆日本血吸虫钙网蛋白(calreticulin,CRT)编码基因,并进行表达、鉴定.方法 以日本血吸虫cDNA为模板,PCR扩增SjCRT编码基因,并与pGEM-T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与表达载体pET28a(+)连接,PCR和双酶切鉴定后测序.IPTG诱导表达重组质粒pET28a-SjCRT,进行SDS变性蛋白质电泳和Western-blot分析,用亲和层析纯化获得重组蛋白.结果 成功地构建了重组质粒pET28a-SjCRT,SDS变性蛋白质电泳显示可见一与预期分子量大小相符的特异蛋白条带的表达.Western blotting分析表明,该重组蛋白能被血吸虫感染小鼠阳性血清识别.亲和层析纯化获得SjCRT重组蛋白.结论 重组质粒SjCRT的构建和重组蛋白的表达和纯化,为进一步探讨其在血吸虫病疫苗和诊断中的应用奠定了基础.     

弓形虫微线体分泌蛋白TgMIC10基因的克隆、表达及鉴定

目的 克隆、表达及鉴定弓形虫（RH株）微线体分泌蛋白TgMIC10编码基因。为建立一种灵敏检测弓形虫感染的实验方法作准备。方法 提取弓形虫速殖子总RNA，设计并合成引物，RT-PCR扩增TgMIC10编码基因，与克隆载体pGEM-T连接。经酶切和PCR鉴定及DNA测序证实后．亚克隆入表达载体pBK-CMV，IPTG诱导表达pBK-TgMIC10阳性重组子转化宿主菌E．coli BL21．Western blot鉴定。结果 PCR法扩增出了一597bp左右的DNA片断，将重组质粒pGEM-TgMIC10、pBK-TgMIC10分别作EcDRⅠ和XbaⅠ双酶切，均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片断。表明Tg—MIC10基因的克隆和亚克隆均获成功，用IPTG诱导带有重组质粒pBK—TgMIC10的大肠杆菌，产物行SDS-PAGE。可得到一约21kDa融合蛋白。Western-blot法鉴定该蛋白能被弓形虫感染的兔血清所识别。     

猪囊尾蚴跨膜蛋白T24基因的克隆及序列分析

目的 寻找猪囊尾蚴病新的免疫学候选诊断分子.方法 设计合成引物,用PCR法从猪囊尾蚴cDNA文库中扩增出猪囊尾蚴跨膜蛋白T24基因编码序列,将其与线性克隆载体PMD-18T连接,分别进行酶切和PCR鉴定及DNA测序证实.结果 PCR法扩增出一条长度约678 bp的特异性片段,将重组质粒PMD-18T-T24作BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,均能得到一个大小与PCR扩增产物一致的插入片段,对插入片段的测序结果表明,T24具有一个长度为678 bp的完整开放阅读框,编码225个氨基酸,理论分子量为23.91 kDa,与GenBank收录的猪囊尾蚴T24基因(编号为AY211879)具有高度的同源性(99.85%).结论 猪囊尾蚴跨膜蛋白T24编码基因克隆成功,为进一步的表达、鉴定及免疫诊断研究奠定了基础.     

抗真菌药敏试验ATBFUNGUS2微量稀释法、ROSCO纸片法和NCCLS纸片法的对比研究

目的对比研究白色假丝酵母菌的体外抗真菌药敏试验ATBFUNGUS2微量稀释法、ROSCO纸片法和NCCLS纸片法。方法采用前述3种方法,检测105株白色假丝酵母样真菌对氟康唑、依曲康唑、两性霉素、氟胞嘧啶的敏感性。结果体外抗真菌药敏试验ATBFUNGUS2微量稀释法、ROSCO纸片法和NCCLS纸片法用于检测白色假丝酵母样真菌有较好的一致性、重复性。结论ATBFUNGUS2微量稀释法和ROSCO纸片法可以作为较好的体外抗真菌药敏试验方法在临床实验室推广使用。     

日本血吸虫(大陆株)14-3-3 epsilon同型信号转导蛋白诱导小鼠保护性免疫的研究

目的：探索日本血吸虫新的疫苗候选分子对小鼠的保护性免疫效果。方法：利用已构建的真核表达质粒pBK-Sj14-3-3在大肠杆菌ＢＬ２１内表达的日本血吸虫（大陆株）14－3－3epsilon同型融合蛋白质，免疫6周龄BALB／c雌性小鼠，免疫3次，每次间隔2周，第3次免疫后2周感染尾蚴。42d后剖杀小鼠，计算其减虫率和肝减卵率。结果：各免疫组与对照组相比，均获得了部分抗血吸虫保护性免疫力，第1、2、3各免疫组的减虫率分别为32．7％（P＜0．05）、30．7％（P＜0．05）、27．5％（P＜0．05）；其肝减卵率分别是48．5％（P＜0．05）、43．1％（P＜0．05）、28．2％（P＜0．05）。结论：首次证明日本血吸虫14－3－3epsilon同型重组融合蛋白可诱导小鼠抗血吸虫感染的部分保护性免疫力。     

增强型绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和表达

目的　构建增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)编码基因的真核表达载体 pcDNA3.1(+) GFP,并观察其在Hep 2细胞中的表达情况。　方法　据已知的EGFP基因序列,设计合成 1 对引物,并引入Hind Ⅲ和EcoR Ⅴ酶切位点。应用PCR技术,从含有 EGFP的 pAdTrack CMV中扩增 EGFP编码基因。通过 TA连接将其克隆入pGEM T easy载体,经PCR及限制性内切酶鉴定后,插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,转化Esche richia coli DH5α感受态细胞,于Amp+ LB平板上筛选阳性克隆。重组子经 Hind Ⅲ和EcoRⅤ双酶切、PCR鉴定,将该载体转染人喉癌细胞 Hep 2 后 48 h观察 EGFP表达情况。　结果　成功构建了含 EGFP 编码基因的真核表达载体pcDNA3.1(+) GFP,并成功转染Hep 2细胞,在倒置荧光显微镜下呈现绿色光。　结论　获得可产生绿色荧光的 EG FP,能方便地用作报告基因和筛选标记。     

依那普利联合灯盏花素对糖尿病大鼠肾脏保护作用及机制

目的探讨依那普利联合灯盏花素对大鼠糖尿病肾脏保护作用及机制。方法大鼠随机分5组：对照组、糖尿病组、依那普利给药组、灯盏花素给药组及依那普利与灯盏花素联合给药组。8周后观察肾组织病理形态学变化，检测尿白蛋白排泄率（AER）、肾组织尿丙二醛（MDA）含量及肾组织蛋白激酶（PKC）活性；应用Western杂交检测肾组织PKC蛋白表达，免疫组化方法检测肾组织转化生长因子（TGF）β1蛋白表达。结果各给药组均可抑制糖尿病大鼠AER增加及肾组织病理结构损害，联合组优于单独给药组；对肾组织及尿MDA含量增加的抑制作用联合组也优于单给药组；各给药组均可抑制肾组织PKC活性与表达，以联合组最明显；糖尿病大鼠肾小球与肾小管-间质TGFβ1蛋白表达明显高于对照组，各给药组肾组织TGFβ1蛋白表达明显低于模型组，其中以联合组最明显。结论依那普利与灯盏花素联合给药对糖尿病肾脏保护作用优于任一单给药组，其机制部分与其对肾组织氧化应激增加、PKC激活及TGFβ1表达有协同抑制作用有关。     

日本血吸虫溶血磷脂酶编码基因真核表达载体的构建和表达及鉴定

目的 从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出溶血磷脂酶编码基因(Si1539),并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),旨在提取重组抗原进行免疫原性分析,并用于免疫学诊断.方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,反转录生成cDNA,PCR法扩增出Sj1539基因,通过克隆载体pGEM-T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),然后转染至人宫颈癌细胞株(HeLa细胞)中表达,表达产物用Western印迹法进行鉴定.结果 Sj1539基因PCR扩增产物片段长度为684 bp.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539经BamH I、Xho I双酶切和PCR扩增鉴定,证实Sj1539基因已成功插入.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539在HeLa细胞中的表达产物经Western印迹法鉴定能够与日本血吸虫感染的兔血清反应,其相对分子质量(Mr)约为25×103.结论 成功构建了日本血吸虫Si1539基因真核表达载体,并获得了表达产物.

Abstract：

Objective Schistasoma japonicum(S.japonicum)lysophospholipase gene(Sjl539)from cDNA of S japonicum adult worms was amplified and subcloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)for expression of recombinant antigen and immunogenicity analysis.Methods Total RNA of S.japonicum was extracted to generato cDNA by RT-PCR.The Sj1539 gent was amplified.The DNA fragment was subcloned into eukaryofic expression vector pcDNA3.1(+)following insertion and amplification in pGEM-T.The recombinant plasmid was transfected into human cervical carcinoma cell strain(Hela cells)and expression products were identified by Western blotting.Results The size of PCR product was approximately 684 bp.It was confirmed that Sj1539 gene had been inserted successfully by the recombinant plasmid digested with two enzymes and PCR.It was verified that the expression product could react with S.japonicum-infected rabbit serum by Western blotting and the molecular weight was approximately 25×103.Conclusions The eukaryotie expression vector carrying Sj1539 gene has been established and the expression product has been obtained.