体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法：差速贴壁＋阿糖胞苷＋胰酶法

目的:通过细胞形态学观察及生物学特性鉴定,建立一种经济实用的体外原代培养纯化新生鼠嗅鞘细胞的实验方法。方法:实验于2006-06在武汉理工大学完成。①阿糖胞苷(Sigma,批号w10562);胎牛血清(杭州四季青产品);胰蛋白酶(Amresco);多聚赖氨酸(Sigma);胶质纤维酸性蛋白,神经生长因子受体蛋白抗体(博士德)。②选取出生3d内的Wistar大鼠5只,乙醇浸泡后断头处死,取嗅球的最外两层,通过1.25g/L胰蛋白酶消化分离嗅鞘细胞,体外原代培养。③采用Nash差速贴壁 阿糖胞苷 胰酶法纯化嗅鞘细胞。培养18h后将未贴壁的细胞悬液转种于另一未涂层的器皿中,再培养36h,重复上述步骤移入0.1g/L多聚赖氨酸包被的塑料培养瓶中进行培养,纯化后的细胞在24h内陆续贴壁,常规培养2d,加入终浓度为2mg/L的阿糖胞苷,作用48h后,换上新的培养基,继续培养1d,弃去培养基,用无钙镁的Hanks液清洗2次,然后用1.25g/L的胰酶消化10min,待细胞突起回缩、胞体变圆时,立刻加入纯血清终止,其血清终浓度为20%,制备单细胞悬液。④倒置显微镜下观察其形态变化,苏木精-伊红染色,同时行神经生长因子受体蛋白和胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色鉴定嗅鞘细胞,并计算嗅鞘细胞阳性百分率。结果:①活细胞形态观察:分离培养的嗅鞘细胞具有双极或多极突起,且突起细长,相互交织。②嗅鞘细胞的苏木精-伊红染色鉴定:细胞呈三角形或梭形,有长的突起,胞浆被染成粉红色,胞核呈蓝紫色,胞核内深染的为核仁,有1～3个核仁。③嗅鞘细胞的胶质纤维酸性蛋白免疫组化染色鉴定:细胞呈现棕黄色,胞核淡染,阳性细胞成网状连接,胞体多为三角形,有细长突起,阳性率91.5%。④嗅鞘细胞的P75免疫组化染色鉴定:阳性细胞呈绿色,多数细胞染色阳性,阳性率89%。结论:实验所采用的Nash差速贴壁 阿糖胞苷 胰酶法分离纯化培养嗅鞘细胞切实可行,为神经诱导修复材料的研究提供种子细胞。     

RGD高分子材料用于周围神经修复的生物学评价

采用自行设计研制的新型可降解仿生RGD高分子材料用于周围神经缺损的修复治疗,研究其促进神经修复的作用。为了了解复合材料的特性,本试验从体外和体内试验多方面进行了评价。研究结果显示,RGD高分子材料导管具有良好的生物相容性,是一种理想的周围神经修复材料。     

新型神经导管复合材料与骨髓间充质干细胞的相容性

背景：理想的神经修复材料要有良好的生物相容性、生物可降解性、可塑性以及一定的机械强度. 目的：观察自行研制的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚（羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料与大鼠骨髓间充质干细胞的细胞相容性. 方法：将从SD大鼠骨髓中分离纯化的第3代骨髓间充质干细胞与精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚（羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料或浸提液共同培养作为实验组,并以含体积分数10%胎牛血清的培养液培养骨髓间充质干细胞作为对照组.观察细胞在复合材料上的生长、存活及凋亡情况. 结果与结论：MTT检测结果显示,共培养5,7 d,实验组吸光度值高于对照组（P〈0.05）;流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染法结果显示,实验组细胞凋亡率显著低于对照组（P〈0.05）;扫描电镜观察见骨髓间充质干细胞在精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚（羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料表面生长良好,胞体发出多个突起,并交织成网状,呈典型的神经元样细胞表现.可见精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸多肽接枝聚（羟基乙酸-L-赖氨酸-乳酸）/聚乳酸/β-磷酸三钙/神经生长因子复合材料与骨髓间充质干细胞具有良好的细胞相容性,可作为优良的载体用于构建人工仿生神经.     

一种新的培养嗅鞘细胞方法(英文)

为了建立一种新的培养嗅鞘细胞的方法,从而为神经诱导修复材料的研究提供种子细胞。本研究取新生鼠的嗅球最外两层经胰蛋白酶消化成单细胞悬液,经差速贴壁法纯化,观察并记录其形态特征;经HE染色以及神经生长因子蛋白受体p75(NGFR-p75)和S-100免疫组化染色鉴定并计算其纯度。结果显示,获得的嗅鞘细胞突起呈双极或三级,p75和S-100阳性细胞纯度达到91%。上述结果提示该方法经济易行,所获得的嗅鞘细胞纯度高、活性好。     

力学性能可控的甲基丙烯酸化明胶（GelMA）人工软骨性能及软骨/骨表界面结合研究

目的 探寻优化骨表面力学匹配的软骨修复材料,并探讨软骨修复材料与骨结合的表界面性能,为软骨修复材料的设计及制备提供依据。方法 以明胶和甲基丙烯酸酐为原料,在明胶分子中引入双键结构,使用紫外光交联的方式制备甲基丙烯酸化明胶（GelMA）水凝胶。运用扫描电子显微镜、万能力学试验机分析水凝胶的形貌、孔径大小和力学性能;体外降解实验、体外拉伸实验评估水凝胶的降解和拉伸特性;黏附能力定性实验、三维立体光学显微镜和扫描电子显微镜评估水凝胶的黏附能力;细胞增殖测试和Live/Dead染色测定细胞活性和毒性。探讨了不同紫外光照时间下GelMA水凝胶的理化性能及软骨/骨材料结合的表界面结合性能,对性能适宜的修复材料进行了配比、力学优化。结果 紫外光照（UV）交联时间为1 min时水凝胶孔隙最大（110.25±6.51）μm,孔隙率高达（45.24±2.78）%;12 h时水凝胶的平衡溶胀比达（148.43±3.84）%;28 d失重率为（17.40±2.38）wt%;水凝胶的拉伸性能随紫外光照时间延长而逐渐增加;GelMA水凝胶对骨髓间充质干细胞增殖无明显抑制作用;水凝胶软骨修复材料与骨的结合良好,可黏附于仿生骨材料表面。结论 紫外光照交联时间1 min时GelMA水凝胶的吸水速率和平衡溶胀比最佳,降解速快,拉伸性能与天然软骨结构类似,具有良好的生物相容性,与骨修复材料力学匹配,该力学性能可控的GelMA水凝胶软骨修复材料为软骨/骨的连接及性能匹配提供了依据。     

栓塞材料的研究进展

本文大致按固体、液体栓塞材料就目前常用的栓塞材料的研究现状进行了综述,并对理想的栓塞材 料及栓塞材料的发展方向进行了探讨。     

神经营养因子体外诱导鼠骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞的基础研究

目的在体外条件下诱导鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化为神经样细胞,作为周围神经损伤修复的基础研究。方法从SD大鼠胫骨和股骨提取BMSCs,采用细胞贴壁法进行培养和纯化,加入碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对第三代BMSCs进行诱导,观察细胞形态变化,并用免疫组织化学方法检测诱导分化后的神经样细胞标志物。结果 BMSCs经诱导后呈典型神经细胞样改变,有两个或多个突起,细胞突起之间相互连接成网状,胞体呈多角形或不规则形,折光性较强,可见细胞核及核仁,免疫组化检测神经元特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)和微管蛋白(β-tubulin)表达阳性,胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)阴性。结论骨髓间充质干细胞具有较强的自我增殖和分化潜能,在适宜的体外条件可诱导分化为神经样细胞,为周围神经损伤修复的研究提供了新思路。     

一种新的组织块培养新生大鼠雪旺细胞方法(英文)

目的:为了建立一种组织块培养雪旺细胞的有效方法,为周围神经组织工程修复的研究提供种子细胞。方法:本研究从新生大鼠的周围神经分离雪旺细胞,经组织块法培养并纯化,观察并记录其形态特征;经HE染色以及S-100免疫组化染色鉴定并计算其纯度。结果:结果显示,4 d后,获得的雪旺细胞突起呈双极或三极,S-100阳性细胞纯度达到95%以上。结论:上述结果表明该方法快速有效,所获得的雪旺细胞纯度高、活性好。     

嗅鞘细胞与神经修复支架材料的相互作用

目的：探讨一种提取高纯度和一定数量的嗅鞘细胞(OECs)的新方法,并研究其与神经支架修复材料PLGL的生物相容性。方法：从新生的 Wister 大鼠身上分离制备嗅鞘细胞并与PLGL共同培养。测量其接触角、吸附率、存活率等。结果：PDLLA的接触角（84.5°±1.5°）明显大于PLGL的接触角（52.6°±0.8°）。PLGL的吸附率（80%）明显高于PDLLA（57%）。PLGL的细胞存活率（88%）明显高于PDLLA（76%）。结论：PLGL比PDLLA具有更好的亲水性、存活率以及良好的细胞生长状况。