ABCB1基因过甲基化修饰在激素性股骨头坏死中的作用

[目的]探讨ABCB1基因过甲基化修饰对激素性股骨头坏死(ONFH)骨髓间充质干细胞(MSCs)功能失调的影响。[方法]选取18例激素性股骨头坏死患者和18例的股骨颈骨折患者,无菌条件下抽取患者股骨骨髓,密度梯度离心法体外分离培养MSCs,取第三代细胞实验。实验分三组:ONFH组(骨坏死患者的MSCs)、5′-氮杂胞苷组(ONFH组的细胞经5′-氮杂胞苷干预72 h)、正常对照组(股骨颈骨折患者的MSCs)。分别检测3组细胞内活性氧(ROS)、线粒体膜电位(MMP)。提取全基因组DNA,亚硫酸氢盐测序(BSP)检测ABCB1基因启动子区的甲基化情况。[结果]与正常对照组相比,ONFH组MSCs增殖能力下降、ROS上升、MMP降低,差异有统计学意义(P0.05)。15μmol/L 5′-氮杂胞苷干预培养后能明显促进ONFH的MSCs增殖能力,降低ROS,提高细胞内的MMP,并且接近正常对照组水平,5′-氮杂胞苷组与ONFH组差异有统计学意义(P0.05)。亚硫酸氢盐测序结果显示:激素性股骨头坏死患者MSCs的ABCB1基因启动子甲基化程度明显高于对照组(P0.05),15μmol/L 5′-氮杂胞苷处理后甲基化程度接近正常对照组水平(P0.05)。[结论]激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞中存在ABCB1基因过甲基化修饰,并导致其功能失调。     

生长分化因子5促进软骨细胞肥大成熟的实验研究

[目的]探讨生长分化因子5(GDF-5)在诱导成人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成软骨分化的同时,促进其肥大成熟的作用.[方法]体外分离培养hBMSCs,取第四代细胞实验.将细胞消化、悬浮,以5×106/ml的细胞密度进行高密度培养,分别用含0.500ng/ml GDF-5的软骨诱导液(CM)诱导培养3、4周.免疫组化、甲苯胺蓝染色检测Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖的表达情况.荧光实时定量RT-PCR检测两组微团Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖mRNA的表达情况.[结果]实验组微团中的细胞体积较对照组稍大,细胞密度稍低.甲苯胺蓝和免疫组化染色结果显示各组微团均有Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和蛋白多糖的表达和分泌,且4周实验组的表达最为强烈.荧光实时定量RT-PCR检测示,干预后3周实验组Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达量明显高于3周对照组(P＜0.05),但Ⅹ型胶原基因表达与对照组相比无显著性差异(P＞0.05);干预后4周实验组Ⅹ型胶原基因表达高于其余各组(P＜0.05),Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达明显高于两对照组(P＜0.05),但与3周实验组相比较,差异无统计学意义(P＞0.05).[结论]GDF-5在诱导细胞成软骨分化的同时,还可促进其成熟肥大.     

IL-38 通过调控PI3K/ Akt/ GSK3β/ NFATc1 信号通路抑制骨质疏松的机制研究

目的:探讨IL-38 抑制骨质疏松的作用并研究其分子机制。方法:共纳入2014 年6 月~2016 年12 月我院收治的138 例骨质疏松患者作为研究对象。另选取120 例同期在我院骨科进行骨折手术的无骨质疏松患者作为对照。采用ELISA 法检测实验对象血清IL-38 水平。构建IL-38-C57BL/6J 转基因小鼠,建立骨质疏松小鼠模型,将野生型、IL-38 转基因小鼠分别设置为假手术组(Sham 组)与卵巢切除组(Ovariectomy,OVX 组)。术后8 周取小鼠血清,检测碱性磷酸酶(ALP)、血钙及血磷水平。另取小鼠的脊柱与双侧股骨,通过病理切片分析股骨组织形态结构,用骨密度仪检测脊柱骨密度变化。将各组小鼠的骨髓基质细胞(BMSCs)进行分离并检测其体外增殖能力,Western blot 检测各组BMSCs 的PI3K、Akt、GSK3β与NFATc1 的磷酸化水平。小鼠成骨细胞MC3T3-E1 转染IL-38 后,Western blot 检测PI3K、Akt、GSK3β与NFATc1 磷酸化水平的变化,流式细胞术检测IL-38 对细胞凋亡的影响。结果:骨质疏松组患者的血清IL-38 水平显著低于对照组(P<0.05)。野生型与IL-38 转基因OVX 小鼠的血钙、血磷水平均显著高于Sham 组(P<0.05),而ALP 水平显著低于Sham 组(P<0.05)。另外,IL-38 转基因OVX 小鼠的血钙和血磷水平均显著低于野生型OVX 小鼠(P<0.05)。股骨病理切片及脊柱骨密度分析显示,野生型与IL-38 转基因OVX 小鼠均出现骨组织形态结构破坏和骨密度下降,并且IL-38 转基因OVX 小鼠的骨组织形态结构破坏和骨密度下降情况均较野生型OVX 小鼠显著减轻(P<0.05)。IL-38 转基因OVX 小鼠BMSCs 的体外增殖能力显著高于野生型OVX 组(P<0.05)。IL-38 转基因OVX 小鼠BMSCs 的PI3K、Akt 与NFATc1 磷酸化水平均显著低于野生型OVX 组(P<0.05),GSK3β磷酸化水平显著高于野生型OVX 组(P<0.05)。MC3T3-E1 细胞转染IL-38 后PI3K、Akt 与NFATc1 的磷酸化水平均显著降低(P<0.05),GSK3β的磷酸化水平显著升高(P<0.05)。流式细胞检测显示转染IL-38 后MC3T3-E1 细胞的凋亡显著减少(P<0.05)。结论:骨质疏松患者的血清IL-38 水平显著降低,IL-38 可能通过调控PI3K/ Akt/ GSK3β/ NFATc1 信号通路促进BMSCs 增殖、抑制成骨细胞凋亡,从而抑制骨质疏松的进展。