脐血与外周血NKT细胞的体外扩增及其表型比较

为了建立体外有效扩增脐血与外周血天然杀伤T细胞(NKT细胞)的方法并研究其表型的差异,分别采用单加IL-2及同时加IL-2和α-半乳糖神经酰胺(α-Galcer)的方法,从人脐血单个核细胞(UCB-MNC)和人外周血单个核细胞(PB-MNC)中扩增NKT细胞;用流式细胞检测技术测定NKT细胞(TCR Vα24+TCR Vβ11+)的比例及其它表型特征。结果显示:UCB-MNC在第7天时,其TCR Vαβ+NKT细胞的扩增量占淋巴细胞的(24.48±4·19)%,是原来的(8.74±4.37)×102倍(P<0.01),而且大多不表达NK1.1(CD161);TCR Vβ11+较TCRVα24+高表达;第14天时,PB-MNC中的TCR Vαβ+NKT细胞扩增量占淋巴细胞的(11.1±3.61)%,是原来的(3·72±2·01)×102倍(P<0.01),且NK1.1高表达,TCR Vβ11+与TCR Vα24+表达率基本一致。结论:α-Galcer对NKT细胞有特异的扩增功能,且脐血NKT的扩增效率较外周血高。以表型划分,脐血中的NKT细胞多为NK1.1-,而外周血多为NK1.1+,是一种新的NKT细胞亚型。     

鞘氨醇-1-磷酸对人耐受型树突状细胞功能影响的初步研究

目的探讨鞘氨醇-1-磷酸(S1P)对外周血单核细胞诱生的人耐受型树突状细胞(tDC)免疫学功能的调控作用。方法 RT-PCR和流式检测细胞表型以及S1P受体(S1PR s)的表达;加入S1P处理tDC,检测其对tDC表型、细胞因子表达以及信号蛋白细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化的影响。结果 tDC高表达DC标志CD209、共刺激分子CD80、CD86和成熟标志CD83;炎性细胞因子mRNA的表达低于未成熟DC,而抑炎性细胞因子、Fas-L和IDOmRNA的表达均高于iDC;tDC表达S1P的受体,S1P与受体相互作用后可引起信号蛋白ERK的磷酸化,上调tDC抑炎性细胞因子以及Fas-L mRNA的表达,对炎性细胞因子的表达无影响。结论 tDC表达S1P受体1、2、5,S1P信号活化后可上调抑炎性细胞因子mRNA的表达,而其表型和炎性细胞因子的分泌无明显变化,有利于tDC免疫耐受功能的发挥。     

S1P/S1PR信号通路对中性粒细胞功能的影响

本研究旨在检测1-磷酸鞘氨醇(S1P)对fMLP活化的中性粒细胞的引发作用,检测粒细胞活化后发生呼吸爆发的产物,并探究S1P引发作用的信号通路。流式细胞术检测新鲜分离的中性粒细胞的状态;高铁细胞色素C还原法间接计算超氧阴离子(O2-)释放量;二氢罗丹明123流式细胞术检测粒细胞的呼吸爆发程度;免疫印迹法检测PI3K-Akt信号通路相关蛋白的表达。结果表明,S1P预处理后fMLP活化的粒细胞所释放的O2-量明显增高;S1P引发的fMLP活化组中,罗丹明123的平均荧光强度明显高于fMLP单独处理组;PI3K及Akt蛋白参与了粒细胞呼吸爆发的信号传递。结论:S1P是一种新的粒细胞引发试剂,较高浓度S1P(10-6μmol/L)能够引发fMLP活化的中性粒细胞发生呼吸爆发;该信号通路可能为S1P与粒细胞上的S1P受体作用,活化下游的PI3K,再通过Akt传递信号,最终活化NADPH氧化酶,发生呼吸爆发。     

无关第三方耐受型树突细胞对小鼠异基因骨髓移植后急性移植物抗宿主病的预防作用

目的 探讨无关第三方耐受型树突细胞(tDC)的生物学特性及其对急性移植物抗宿主病(aGVHD)的预防作用.方法 用GM-CSF、IL-10和TGF-β1诱导培养D1小鼠骨髓源tDC,用流式细胞术检测细胞表型,用RT-PCR方法检测细胞因子基因表达情况.采用混合淋巴细胞反应法检测其体外对异基因小鼠CD4+T细胞增殖的影响;将D1小鼠骨髓源tDC按不同剂量分组输注给aGVHD小鼠模型(B6→D2),观察受鼠一般状况、生存率、临床GVHD评分、血清中Th1/Th2细胞因子水平的变化,并以单纯aGVHD模型为对照组进行比较.结果 流式细胞术检测结果表明tDC表达低水平的MHC Ⅱ分子(I-A/I-E)和共刺激分子(CD80、CD86、CD40).RT-PCR结果表明,tDC低水平表达炎性细胞因子IL-12p40,但高水平表达免疫抑制性因子IL-10、TGF-β、FasL、IDO和精氨酸酶.无关第三方tDC在体外能够有效抑制异基因CD4+T细胞的增殖,并且这种抑制效应与tDC的剂量有关;小鼠体内实验显示,aGVHD对照组小鼠在移植后18 d内全部死亡;而接受无关第三方tDC输注组小鼠aGVHD症状均有所改善,其中输注104 tDC的受鼠有60%能存活至60 d以上,无明显的GVHD症状.而输注103 tDC的小鼠仅有20%能存活至移植后第60天,输注105 tDC的小鼠则在移植后37 d内全部死亡.移植21 d时,输注103、104、105无关第三方tDC的小鼠血清内IL-10水平分别为(114.23±7.78)、(646.18±212.02)、(121.97±10.47)ng/L,104 tDC组显著高于其他组(P<0.05).结论 经IL-10和TGF-β1诱导的无关第三方tDC在体外能够抑制CD4+T细胞的增殖,对aGVHD有显著的预防作用,这种作用与tDC剂量和IL-10的高表达有关.过继性输注一定量的无关第三方tDC能显著延长aGVHD小鼠的生存期,有效预防异基因骨髓移植小鼠aGVHD的发生.     

不同来源的树突状细胞对扩增脐血NKT的影响

目的 比较不同来源的DC对扩增脐血NKT的影响.方法 分别以外周血和脐血为来源诱生DC,在α-Galcer和IL-2的联合刺激下,对脐血中的NKT进行扩增.用流式细胞检测技术分析不同来源DC的表型区别,并对它们扩增的NKT细胞(TCR Va24 TCR Vβ11 )进行鉴定.结果 在14 d的培养时间里,由PB-Dc参与的TCR Vαβ NKT细胞的扩增量占淋巴细胞的(20.8±5.25)%,是原来的(8.22±2.75)×102倍;而由CB-DC参与的TCR Vαβ NKT为(11.26±5.63)%,是原来的(4.66±2.12)×102倍;未加DC组,单用α-Galcer和IL-2,NKT的最终扩增量也达到了(10.84±4.00)%.3组较原来都呈现显著性扩增(P＜0.01),其中以PB-DC参与的NKT扩增组效率最高(P＜0.001).经流式检测,PB来源的DC,其表面CDld表达明显高于CB来源的DC(P＜0.001),而共刺激分子则较脐血DC低.结论 α-Galeer对NKT细胞有特异地扩增功能;NKT的扩增效率与DC细胞之间有着密切的关联,以外周血为来源的DC,其协同刺激脐带血NKT的扩增功能较脐血DC强.     

胶原诱导性关节炎炎症条件下诱导的调节性T 细胞与B 细胞的相互作用

目的:探讨胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠炎症条件下,诱导的调节性T 细胞(iTregs)与B 细胞的相互作用模 式。方法:分别从正常DBA1/ J 和免疫后第35 天的关节炎小鼠的脾脏细胞分选出CD19+细胞(N-B 和CIA-B 细胞),以此细胞 作为抗原提呈细胞观察其诱导Tregs 生成的差异;经典方法制备iTregs,将CIA-B 细胞与iTregs 共培养,观察其对iTregs 自身的 增殖及iTregs 表达CTLA鄄4 的影响;观察iTregs 对CIA-B 细胞共刺激分子(CD80,CD86)和MHC域类分子表达的影响,并设立 Transwell 实验探讨作用机制。结果:CIA-B 较N-B 诱导更多Tregs 的生成;CIA-B 促进iTregs 的增殖并上调iTregs 细胞表面 CTLA-4 的表达,后者的作用是通过细胞直接接触的途径实现;同时,iTregs 促进CIA-B 细胞表面共刺激分子和MHC域类分子 的表达且该作用也通过细胞直接接触途径而实现。结论:在CIA 炎症条件下,iTregs 通过与B 细胞的相互作用来发挥其免疫 抑制作用,两者的相互作用通过细胞直接接触实现。     

不同方法测定血红蛋白溶液中总蛋白量的比较

目的采用三种方法对含有大量血红蛋白溶液的样本测定总蛋白量,并进行比较,确定一种可行且简单的测定血红蛋白溶液中总蛋白量的方法.方法分别采用BCA法、Bradford法和Lowry法测定溶液总蛋白量,并采用HiCN法测定溶液中血红蛋白的含量.比较不同方法测得数据的差异.结果 5份样本用BCA法测得总蛋白量为76.33 g/L,Bradford法测得值为179.59 g/L,Lowry法测得值为22.81 g/L.HiCN法测定血红蛋白量为133.65 g/L.结论 Bradford法是一种可行且重复性好的测定血红蛋白溶液中总蛋白量的方法,BCA法和Lowry法的测定结果明显低于实际值.     

血红蛋白衍生物类红细胞代用品研究进展

本文简要介绍了血红蛋白衍生物类红细胞代用品的研究进展、开发现状和临床应用前景。     

调节性DC分泌exosomes对急性GVHD抑制作用的初步研究

目的探讨调节性树突状细胞（rDC）分泌exosomes在移植物抗宿主病（GVHD）模型中的免疫抑制作用。方法用TGF-β1和IL-10诱导从C57BL／6小鼠骨髓来源产生rDC,负载DBA／2小鼠来源的抗原,应用流式检测rDC表型。采用超速离心结合膜超滤的方法分离纯化rDC分泌的exosomes,电镜检测exosomes形态。在以DBA／2小鼠为受鼠,C57BL／6小鼠为供鼠的急性GVHD模型中,尾静脉注射rDC分泌的exosomes,观察受鼠急性GVHD症状的改变。结果rDC的I—A／I—E（MHC一Ⅱ类分子）,共刺激分子CD80、CD86表达量均比未成熟树突状细胞（imDC）低,其分泌的exosomes为直径小于100nm的小囊泡。在小鼠急性GVHD模型中,同种异基因骨髓移植0、7、14d静脉注射rDex（15μg／只）治疗的小鼠,GVHD表现较对照组症状轻,生存期较长,两组相比差异有统计学意义（P〈0．05）;且较静脉注射rDex30pg／只的治疗效果好。结论rDC分泌的exosomes能够提高GVHD小鼠生存率,可应用于治疗急性GVHD。     

同种异基因抗原特异性调节性T细胞的体外扩增

目的建立用人B淋巴细胞体外获得大量的同种异基因抗原特异性调节性T(Treg)细胞的方法,以此检测扩增细胞的表型及其免疫无能性和免疫抑制性。方法第1轮扩增将免疫磁珠分选的人CD4+CD25+T细胞和人B淋巴细胞按1∶4体外混合培养,并加入外源白介素-2(IL-2)和抗-CD28;将第1轮扩增得到的Treg细胞用抗-CD3/CD28包被的免疫磁珠和IL-2刺激,做第2轮扩增以获得更多数量的抗原特异性Treg细胞,分为添加和或未添加免疫抑制剂雷帕霉素(RAPA)2组(n=3)。结果经过2轮的扩增后,在第2轮扩增中未添加RAPA组扩增1×103倍,纯度80%;添加RAPA组扩增0.8×103倍,纯度90%。添加RAPA组得到的Treg细胞的Foxp3、CT-LA4、CD39表达水平高于未添加RAPA组,但是HLA-DR变化不大;未添加RAPA组扩增得到的Treg细胞分泌低水平的IL-2、IL-17、IL-4和IFN-γ,而添加RAPA组得到的Treg细胞几乎不分泌上述各种细胞因子,前者表现出部分免疫反应无能性,后者表现出完全的免疫反应无能性,两者都表现出免疫抑制性功能特征。人B淋巴细胞扩增得到的抗原特异性Treg细胞能够极大地抑制同源抗原引起的免疫反应,而对多克隆刺激的免疫反应抑制能力较弱。结论用人B细胞体外扩增抗原特异性Treg细胞,再通过抗-CD3/CD28包被的免疫磁珠进一步刺激可以体外获得大量的抗原特异性的Treg细胞,加入RAPA后可有效地提高Treg细胞的纯度和免疫抑制力且呈现抗原特异性。