siRNA联合顺铂抑制骨肉瘤细胞增殖的研究

目的构建人Survivin基因的siRNA真核表达载体,探讨其对骨肉瘤细胞MG63凋亡及顺铂化疗的增敏作用。方法应用pSilencer 3.0-H1 neo,构建Survivin特异性的RNA干涉载体,转染MG63细胞,G418筛选稳定转染的细胞系。半定量PCR和免疫荧光染色分别检测Survivin mRNA与蛋白的水平变化。Annexin V法检测细胞凋亡。MTT法检测顺铂对细胞的杀伤作用。结果构建Survivin基因siRNA真核表达载体PsiS。获得了稳定转染的细胞系。与MG63、阴性对照细胞比较,MG63/PsiS生长曲线则十分平缓。MG63/PsiS细胞中Survivin的mRNA及蛋白表达明显减少。MG63/PsiS凋亡率增加为17.8%(P<0.01)。1 mg/L顺铂作用下,MG63/PsiS死亡率是其他各组的2.3倍(P<0.01)。结论特异性siRNA能够明显阻断Survivin基因的表达促进MG63细胞凋亡,提高细胞对顺铂的敏感性。     

靶向Survivin基因的短发卡RNA在体内对U251细胞移植瘤的影响

Surivin基因属于凋死蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis,IAP）家族，具有抗细胞凋亡、促细胞增殖和促血管形成等多种生物学活性，其在脑胶质瘤发生和发展过程中的作用尚不完全明确，本研究结盟在观察稳定转染靶向Survivin基因的特异性短发卡RNA（shRNA）真核表达载体对人脑胶质母细胞瘤U251细胞裸鼠体内肿瘤生长和血管形成的影响。方法：将U251细胞，稳定转染Survivin基因shRNA真核表达载体pWHI-SR的U251-SR细胞，以及稳定转染空载体pWHI的U251-P细胞，分别接种于裸鼠背部皮下，建立人脑胶质瘤裸鼠皮下移植瘤模型，定期观察肿瘤生长情况，测定肿瘤体积、绘制肿瘤生长曲线，观察45天后处死动物、称瘤重，采用免疫组化SABC法检测Survivin、增殖细胞核抗原（proliferating cell muclear antigen，PCNA）以及八因子相关抗原（factor Ⅷ related antigen,FⅧRAg）在各组肿瘤标本中的表达，采用TUNEL法检测凋亡细胞，分别计算各组肿瘤标本的增殖指数（proliferative index,PI），凋亡指数（apoptotie index,AI）以及微血管密度（microvessel density,MVD）。结果：与U251、U251-SR组肿瘤标本，U251-SR组裸鼠肿瘤形成时间延迟，肿瘤生长缓慢，肿瘤体积及瘤重均明显减小（P〈0.01）；U251-P组裸鼠相丝，U251-SR组肿瘤标本Survivin蛋白表达明显下调：PI和MVD明显减少，AI明显升高（P〈0.001）。结论：靶向Survivin基因的sbRNA能够在体内明显抑制U251细胞的肿瘤生长和血管形成，Survivn基因可作为脑胶质瘤基因治疗的一个良好靶点，而RNA干涉（RNA interference,RNAi）技术可为脑胶瘤基因治疗的一个良好靶点，而RNA干涉（RNA interference，RNAi）技术可为脑胶质瘤的基因治疗提供新的重点手段。     

基因治疗成骨肉瘤的探索：人成骨肉瘤细胞CD147基因编码区克隆和反义RNA表达质粒构建

目的:构建CD147反义RNA表达质粒载体,探索治疗骨肉瘤侵袭和转移的新方法.方法:实验于2004-05在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所实施,以人成骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板,采用反转录聚合酶链反应方法得到人CD147的编码区cDNA,用DNA重组技术将人CD147编码区基因反向克隆到真核表达质粒PcDNA3.1( )中,构建成CD147反义RNA表达质粒PcDNAasCD147.用阳离子脂质体介导转染人成骨肉瘤细胞系MG63,经G418筛选后获得的克隆进行鉴定. 结果:CD147反义RNA表达质粒载体PcDNAasCD147经限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确.免疫组化SP法染色证实:转染细胞MG63/PcDNAasCD147,与亲本细胞相比,CD147的表达明显下降.结论:成功地从人成骨肉瘤细胞中克隆出CD147编码区基因,构建了CD147反义RNA表达质粒载体PcDNAas CD147,此实验结果为进一步研究CD147蛋白分子的生物学功能以及为成骨肉瘤的基因治疗研究奠定了基础.     

骨保护素对破骨细胞分化和骨吸收活性的抑制作用

背景：骨保护素(osteoprotegerin，OPG)可抑制破骨细胞的分化，抑制成熟破骨细胞的骨吸收活性并诱导其凋亡，在骨质疏松、类风湿性关节炎、癌症骨转移的领域有潜在的应用价值。目的：鉴定在CHO细胞中表达的人骨保护素生物学活性。设计：随机对照的实验研究。地点和对象：实验在解放军第四军医大学西京医院骨科研究所完成，研究对象：人骨肉瘤细胞株MG63、中国仓鼠CHO细胞株、克隆质粒pUC19及真核表达质粒pcDNA3为本室保存，12只6～8周龄BABL／c雄性小鼠由本校动物中心提供。干预：RT-PCR法获得人OPG编码区cDNA并构建真核表达载体，在脂质体介导下转染CHO细胞，经Western blot鉴定筛选稳定表达OPG的细胞系。获取含有OPG蛋白的条件培养基浓缩液，实验组：体外培养的鼠破骨细胞培养基中加人含有OPG蛋白的条件培养基浓缩液。对照组1只加入转染pcDNA3空载体的CHO细胞培养基的浓缩液。对照组2只加入完全培养基。主要观察指标：观察人OPG对破骨细胞的分化和骨吸收的影响。结果：转染人OPG编码区基因的CHO细胞能分泌表达OPG。小鼠骨髓细胞在la，25(OH)zD3(1&;#215;10^-8mol／L)的存在下可稳定分化出具有骨吸收功能的破骨细胞样细胞，在该培养体系中加入含有OPG的CHO细胞培养上清浓缩液，TRAP染色阳性细胞数明显减少(t=5．547，p&;lt;0．01)，骨吸收陷窝的数量显著减少(t=3．409，P&;lt;0．01)。结论：人骨保护素可在CHO细胞中分泌表达，并对体外培养状态下的破骨细胞的分化和骨吸收功能有抑制作用。     

人工全髋关节置换骨水泥和无骨水泥假体股骨近端广泛骨溶解的定量分析

背景:目前国内文献只对股骨近端骨溶解进行形态学的观察,尚无定量研究的报告。目的:通过股骨近端骨密度的变化规律,定量分析人工全关节置换术后股骨近端骨溶解改变情况。设计:患者自身前后对照观察。单位:解放军第四军医大学唐都医院骨科。对象:选择1994-03/2004-03第四军医大学唐都医院骨科完成的人工全髋关节置换术患者26例28髋,男14例16髋,女12例12髋。假体类型:改良Moore型骨水泥假体16例17髋为骨水泥假体组,平均年龄57岁;无骨水泥表面微孔型假体10例11髋为无骨水泥假体组,(下转第192页)平均年龄55岁。术前患者诊断均为创伤性关节炎,术前Harris髋关节评分平均49(20～77)分。两组患者在年龄、性别、术前诊断方面均匹配。方法:用计算机图像分析方法测两组患者X射线片灰度值,取相对值,即同一张X射线片分别测髂骨、股骨大转子处l.0～2.0cm2面积上平均灰度值,二者差值代表股骨大转子处骨密度的相对值,并定量分析骨密度改变的规律。主要观察指标:术前1周、术后1周、随访期两组患者股骨大转子处骨密度相对值。结果:26例患者(28髋)随访9个月～10年6个月,全部进入结果分析。随访期骨水泥组和无骨水泥组股骨大转子处骨密度相对值均较术后1(上接第189页)周有不同程度的增大,骨溶解发生率100%;无骨水泥组股骨大转子处骨密度相对值随访期平均值72.8(14～130),骨水泥组平均值57.4(9～118),两组差异无显著性意义(P>0.05)。最早发生骨溶解为术后9个月,术后2～4年内骨溶解改变最明显,第6年呈减缓趋势。结论:人工全髋关节置换术后骨溶解在骨水泥假体和无骨水泥假体都存在,二者无显著差异。     

人工全髋关节置换骨水泥和无骨水泥假体术后疗效及假体可能的生存率比较

背景:人工关节置换者最关心的是人工假体寿命。目的:回顾性方法综合评价人工全髋关节置换术骨水泥和无骨水泥假体术后疗效,以期为延长人工关节的寿命提供经验。设计:随机对照观察。单位:第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所、全军骨科中心。对象:解放军第四军医大学唐都医院骨科1993-03/2004-03行人工全髋关节置换术患者356例,获得通讯联系的298例,获得随访105例(108髋),均自愿回访,性别不限,假体类型2000年以前为国产假体,使用国产骨水泥,2000年以后使用美国STRIKER公司的假体,骨水泥由该公司提供。骨水泥中均加有钡剂。患者手术全部由经考核进入人工关节组的医生进行。方法:参照1982年中华外科髋关节人工置换座谈纪要及Mayo人工髋关节疗效评价表,自行设计随访信,对105例(108髋)患者进行随访,其中骨水泥组62例(63髋),无骨水泥组43例(45髋),并对术后患者在疼痛、功能、关节活动范围及X-ray片进行综合性评价和分析。主要观察指标:①患者术后疼痛程度。②患者术后髋关节功能情况。③患者术后关节活动范围。④患者假体周围透亮线、假体水平或垂直移位的距离。⑤患者假体异位骨化的范围。⑥患者股骨近端骨溶解程度。结果:①随访期股前外侧疼痛两组差别不显著[骨水泥组24髋(38.5%),无骨水泥组18髋(40.0%)]。②随访期两组均有跛行。③随访期患者髋关节活动范围160°以上两组无显著差异(骨水泥组62髋,无骨水泥组44髋)。④股骨假体的下沉和髋臼假体的水平、垂直移位两组患者中差别不显著。⑤随访期骨水泥组股骨近端骨密度相对值57.4(9～118),无骨水泥组股骨近端骨密度相对值72.8(14～130),差别不显著。⑥两组患者术后疗效及假体可能生存率,股骨近端广泛骨溶解无显著差异。结论:无论骨水泥假体还是无骨水泥假体患者术后疗效相似,假体都没有达到理想固定的效果。假体类型的选择并不影响假体的寿命,要根据患者的年龄及是否还要行翻修术来决定假体类型;骨溶解与患者年龄、性别、假体类型无关。     

Survivin表达与脑胶质瘤增殖、凋亡及血管生成的关系

Survivin是凋亡蛋白抑制因子（IAP）家族的一个新成员，具有强大的抗细胞凋亡、促有丝分裂以及促血管生成作用，并与人类多种肿瘤的形成密切相关。本研究检测了Survivin蛋白在脑胶质瘤中的表达水平，进一步分析了其与脑胶质瘤恶性增殖、凋亡以及血管生成的关系。     

异体DBM骨粒复合rhBMP-2及骨水泥材料修复骨缺损的实验研究

目的探讨异体脱钙骨基质（DBM）骨粒、骨水泥（BC）及重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）复合材料修复实验性骨缺损的能力。方法复合材料植入兔实验性尺骨骨缺损部位（A组），B组植入纯骨水泥棒材作为对照。不同时间行组织学、印度墨汁动脉血管灌注及材料自然断面扫描电镜观察。结果材料植入第2周表面纤维组织样完整包膜形成，材料外周及两端血管形成密集，并向材料中长入；第4、8、12周新生血管明显增多，且深入至材料中央，新生间充质组织继续大量长入；包绕DBM骨粒的间充质组织部分4周转化为软骨。第8、12周软骨趋于成熟，可见含有造血骨髓的新生骨组织形成，其间可见较多的哈佛氏系统；同时，可见明显DBM骨粒被新生组织爬行吸收现象。第4周原自然裂隙部分已被结构紊乱的胶原纤维束充填。第8至12周，可见大量排列紊乱的矿化骨结构沿多方向长入，新生骨组织附于脱钙骨基质骨粒及骨水泥表面，原自然裂隙几近消失。植入B组材料者除外被纤维膜外余无变化。结论脱钙骨基质骨粒、骨形态发生蛋白、骨水泥复合材料具有良好的骨诱导及骨引导生成作用，是良好的骨缺损修复材料。     

年龄对肺癌外科治疗的影响

目的:探讨年龄与肺癌外科治疗的关系。方法:回顾性分析我科2005年2月~2006年2月手术治疗肺癌患者217例的临床资料。结果:在各年龄段,肺癌好发部位均为肺上叶,鳞癌多见。随着年龄的增加,肺癌患者术前合并其他疾病增多,肺功能下降,手术方式的选择趋于保守,术后并发症逐步增加。但只要加强围手术期的管理和治疗,大多数术后并发症均可治愈。结论:对于各年龄段肺癌患者,在选择适当的手术方式和正确的围手术期处理的基础上,应积极手术治疗。     

tBid基因的表达及其对骨肉瘤SOSP-9607细胞的促凋亡作用

目的：观察tBid基因在骨肉瘤细胞中的表达及其对转染的SOSP-9607细胞的凋亡作用。方法：采用脂质体转染的方法,将tBid基因转染骨肉瘤细胞,间接免疫荧光法检测目的蛋白的表达和细胞形态学变化,进一步电镜观察其超微结构改变。MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况,通过Annexin V、染色流式细胞仪检测来观察其促凋亡作用。结果：转染SOSP-9607细胞后,间接免疫荧光染色检测tBid的表达,细胞出现凋亡。电镜观察呈现出典型的凋亡特征。MTT实验发现细胞的增殖被明显抑制。Annexin V染色流式细胞仪检测可见明显的凋亡细胞,与对照组细胞（凋亡率为6%）相比,其凋亡率为35.8%。结论：tBid基因可以在转染的SOSP-9607细胞中表达,并可抑制转染细胞的生长,诱导细胞发生凋亡。