Ⅲ型中国株HCV E2/NS1基因的扩增及其哺乳动物细胞表达质粒克隆构建

Ⅲ型中国株ＨＣＶＥ２／ＮＳ１基因的扩增及其哺乳动物细胞表达质粒克隆构建吴朝栋陶其敏杜绍财常锦红（北京医科大学人民医院肝病研究所，北京１０００４４）Ｅ２／ＮＳ１基因被认为是丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因组的结构区基因，具有较大的变异性［１］，而且在不同的...     

HCV NS5 b套式PCR在酶切基因分型研究中的应用

目的：探讨ＨＣＶ ＮＳ５ ｂ区酶切分型技术在临床上的应用。方法：选用了ＨｐａⅡ、Ｃｆｒ１０Ⅰ、ＡｌｕⅠ、ＨｈａⅠ、ＨａｅⅢ、ＡｖａⅡ、ＴａｑⅠ、ＢｓｔＮⅠ、Ｓａｖ３ＡⅠ、ＳｔｕⅠ、ＢａｌⅠ、ＳｍａⅠ等１３种限制性内切酶,对已知２３例１ｂ型和１７例２ａ型样品进行酶切分析和验证。结果：４０例ＮＳ５ｂ分型结果表明２３例１ｂ型中有ＡｌｕⅠ特异切点,无１ａ的ＢａｌⅠ切点和２ｂ的ＭｂｏⅠ切点,１７例２ａ型中无     

丙型肝炎诊断试剂的研究

本文用分子生物学方法根据中国人HCV基因特点进行多肽合成,研究丙型肝炎C区、E区酶标试剂的临床应用以及与抗C 100-3试剂的比较,并以 RT双 PCR的方法建立了HCV RNA的检测试剂及临床应用。结果发现抗-CP试剂敏感性、特异性均优于抗C100-3,从临床检测结果看,在自然人群中感染率抗-CP为2.8％,抗C100-3为2.1％,特别在输血后肝炎中,抗 CP阳性率高达 71.7％～75.9％。因此提出对HCV的诊断确立与愈后判断各类试剂有各自的作用,不能只根据某一试剂的某一次结果而简单地否定 HCV感染。HCV RNA测定,建立了5’末端非编码区及非结构区(NS 1),采用双PCR观察结果抗-CP阳性者绝大多数为RNA阳性,并提示将有助于抗病毒药物疗效的观察指标。     

82例 HCV RNA 阳性血清聚合酶链反应产物的酶切分析

为了探讨广州地区ＨＣＶ感染的基因型，作者对广州地区不同人群中１０５例抗－ＨＣＶ阳性血清用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）进行了ＨＣＶＲＮＡ的检测，对其中８２例ＨＣＶＲＮＡ阳性患者血清做了ＰＣＲ产物的限制性内切片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析，结果显示：ＨＣＶⅡ型感染７８例（９２．１％），ＨＣＶⅢ型１例，ＨＣＶⅡ／Ⅲ型混合感染３例，４例ＨＣＶⅢ型感染均是肝病患者，初步表明广州地区ＨＣＶ感染大多数属Ⅱ型。     

丙型肝炎病毒非编码区ABC程序酶切分型研究

目的为进一步了解中国是否存在HCV 3b基因及1a、2b和6a基因型感染，建立HCV 5′端非编码区(5′ NCR)不同基因型的基因库。方法分型方法按ABC程序进行，A应用BHH′(BsrBⅠ、HaeⅡ、HinfⅠ)复介内切酶消化5′NCR cDNA，可将不同基因型划分为5组：1a、1b，6a，2a、2b，3a，3b、4a。B应用BstU Ⅰ内切酶鉴别1a、1b。C应用Hae Ⅲ内切酶鉴别2a、2b、3b、4a及6a。电泳检测片段大小。结果(1)la、1b、2a、2b、3a、3b、4a、6a 8种基因型参比品的ABC分型结果表明，该8种基因型获得良好的分型效果。(2)93份HCV RNA阳性患者ABC分型结果表明，1b型感染率占66．67％，2a型18．28％，1b／2b型、3b型及2b型均为3．23％，2a／2b型和1b／2a型各为2．15％，1a型1．08％。结论结果表明应用HCV 5′-NCR ABC分型技术既保证了HCV RNA检测的灵敏度，又能完成1a-6a型中的8种基因型的鉴别。     

脱氧尿嘧啶核苷酸掺入量对尿苷酶抗污染效果的影响

目的 了解脱氧尿嘧啶核苷酸（dUTP)掺入量与尿苷酶（UDG）抗污染的关系。方法 通过聚合酶链反应将50％ dUTP和全dUTP掺入HCV cDNA，并观察UDG的抗污染效果。结果 0．05U、0．1U、0．2U的UDG37℃消化60min,PAGE检测可抗10^-1－10^-8 50％ dU-DNA模板污染。0．1U UDG 37℃ 10min能抗10^-6,20min-30min可抗10^-5,PAGE虽阴性，但DNA－EIA杂交A值0．617，仍为阳性；40min可抗10^-3，未经杂交证实。37℃消化20min电泳检测可抗10^-1-10^-8全dU-DNA污染，DNA－EIA杂交A值在0．005－0．049均为阴性。结论 本文研究结果证实，用50％ dU-DNA为模板，37℃ 10-20min时，抗污染效果较差，需增加抗污染时间。应用全dU-DNA为模板时，可获得良好的抗污染效果。     

~3H乙肝病毒DNA探针在分子杂交检测血清中乙肝病毒DNA的临床应用

自从1983年本所建立斑点分子杂交方法检测血清乙肝病毒DNA以来,(以下简称斑试)有数篇报导应用~(32)P乙肝病毒DNA探针进行临床检测。说明斑试敏感、特异,并证实了乙肝病毒DNA与HBeAg、Dane颗粒、DNAP之间有良好的相关性,一些资料表明将~(32)P乙肝病毒DNA探针应用SouthernBlot法检测肝组织内乙肝病毒DNA状态。~3H乙肝病毒DNA探针过去多用于肝组织内病毒的原位杂交。我们应用缺刻转移标记制     

利用基因参照品图谱分析克拉玛依地区HBV基因型

目的了解克拉玛依地区HBV基因型分布状况,比较其与GenBank HBV序列同源性以及进化树分析。方法通过对S基因区B、C、D型GenBank序列分析,研究MboⅠ酶和EarⅠ酶在不同型中具有独特的切点,利用限制性片段多态性分析(PCR_RFLP)区分各型,将各个基因型与GenBank序列进行1∶1同源性比对的进化树分析。结果272份样品有241份成功分型。C型44.8%,B型36.9%,D型4.1%,B C型10.8%,B D型3.3%。少数民族C型40.4%,B型30.7%,D型9.6%。B、C、D型的同源性分别是97.8%~98.7%,96.9%~99.3%,97.5%~99.0%。进化树分析发现,克拉玛依地区的2例D型与新疆哈密地区D型进化距离最近。结论克拉玛依地区HBV基因型B、C、D均有,以B、C型占优势,未检测到A型,D型与新疆哈密地区D型有较近的亲缘关系。     

丙型肝炎病毒基因分型的研究进展

丙型肝炎病毒（HCV）属于黄病毒科（Flaviviridae）,其基因组为单股正链RNA,易变异,目前可分为6个基因型及不同亚型,根据2005年新达成的HCV基因型命名规则共识,以阿拉伯数字表示HCV基因型,以小写的英文字母表示基因的亚型（如1a、2b、3c等）.由于1型和4型对于聚乙二醇干扰素联合利巴韦林标准化治疗较2型和3型更为耐药,因此HCV基因型检测在临床上具有重要意义.2004年中国《丙型肝炎防治指南》指出,HCV RNA基因分型有助于判定治疗的难易程度及制定抗病毒治疗的个体化方案.     

中国HCV5′-非编码区复合酶切分型及其3b基因型序列分析

目的　研究中国丙型肝炎病毒 (HCV)不同基因型感染分布情况 ,并对 3b序列进行分析。方法　采用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术扩增HCV5’NCR 1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、6a不同基因型的cDNA及 187份HCVRNA阳性样品中cDNA。A应用BHH (BsrBI、HaeⅡ、HinfI)复合内切酶消化 5′ NCRcDNA ,B应用BstUⅠ消化 ,C应用HaeⅢ消化 ,电泳检测片段大小。结果　 187例HCVRNA阳性患者ABC分型结果表明 ,1b型感染率占 6 7 38% ,2a型 12 30 % ,1b/ 2a型为5 88% ,3b型 5 35 % ,2b型 3 2 1% ,2a/ 2b、1b/ 2b型各为 2 14 % ,1a型 1 0 7,6a型 0 5 4 %。 3份 3b基因型 5’ NCRA T克隆测序结果表明 ,3株 3b型之间同源性为 99 5 4 %～ 10 0 %。其中chiKQ5 0与GI5 14 395 3a株为 96 2 8%与GI6 76 8773b株同源性为 98 6 % ,与 1a型为 93 4 9% ,与 1b型为94 88% ,与 2a型为 91 6 3% ,与 2b型为 89 30 % ,与 4a型为 95 35 % ,与 6a型为 93 4 % ,结论　研究结果表明该项分型技术既保证了RT PCR检测灵敏度 ,又具有良好的分型效果。提示 :该分型方法不仅适合中国HCV基因型检测 ,对亚洲及欧洲和非洲HCV分型研究也具有一定的参考价值