兔脂肪间充质干细胞分离培养及其向神经细胞分化的特征

目的:分离培养兔脂肪间充质干细胞,探讨兔脂肪间充质干细胞在体外向神经细胞分化的能力。方法:实验于2002-09/2005-09在陕西省干细胞工程技术研究中心完成。选取清洁级新西兰大白兔5只,采用Ⅰ型胶原酶消化兔腹股沟皮下脂肪组织,分离培养脂肪间充质干细胞。取生长状况良好的第2,5,10代细胞,绘制生长曲线,计算细胞群体倍增时间。采用免疫组化方法对脂肪间充质干细胞表面分子标志[CD14,CD29,CD34,CD44,CD45,CD105及人白细胞抗原DR亚类(群)]进行鉴定,并采用1,2.5,5,10mmol/L不同浓度的β-巯基乙醇检测脂肪间充质干细胞向神经细胞分化的能力。结果:①脂肪间充质干细胞生长曲线分析:第2,5,10代细胞体外传代培养的潜伏期约为24～48h,传代培养细胞的对数增殖期为6d,接种后第9天进入平台期。在细胞生长的对数期,脂肪间充质干细胞的倍增时间为64.12h。②脂肪间充质干细胞分子特征的鉴定结果:第2～5代细胞90%以上CD29,CD44,CD105呈阳性表达,而不表达CD14,CD34,CD45及人白细胞抗原DR亚类(群)等表面分子标记。③脂肪间充质干细胞向神经细胞分化情况:体外能够分化为神经细胞。结论:兔脂肪组织可分离培养出脂肪间充质干细胞,并能够向神经细胞分化,有望成为组织工程的种子细胞来源。     

胰蛋白酶预消化后植块法分离培养人胚成骨细胞

目的:改良成骨细胞分离培养方法,为骨形成、骨代谢以及骨组织工程等基础研究提供种子细胞。方法:实验于2002-09/2005-09在陕西省干细胞工程技术研究中心完成。①无菌条件下取五六个月龄流产胎儿颅盖骨(家属知情同意),去除骨膜及周围结缔组织,然后用2.5g/L胰蛋白酶消化20min,终止消化后,去除骨缝组织,剪碎,将碎骨块接种于培养瓶中分离培养成骨细胞。②细胞纯化采用差速贴壁法。通过相差显微镜观察人胚成骨细胞原代和传代培养的生长特征。③用碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色等方法对所获得的成骨细胞进行鉴定。结果:①人胚成骨细胞原代和传代培养的生长特征:原代培养至第5天,骨块边缘出现零散的细胞,这些细胞的形态主要为梭形、三角形或多边形。原代培养第14天后,形成融合层,细胞呈圆形、卵圆形或方形紧密排列,叠层生长。传代细胞主要呈三角形或方形细胞,细胞排列无方向性,出现集落样生长趋势。②人胚成骨细胞的鉴定结果:90%以上分离获得细胞碱性磷酸酶染色和钙结节染色均呈阳性。结论:采用酶消化后植块的改良植块培养法可在较短时间内获得大量成骨细胞,这些细胞具有典型的成骨细胞形态和功能,是一种较好的分离培养人胚成骨细胞的方法。     

胰蛋白酶预消化后植块法分离培养人胚成骨细胞

目的：改良成骨细胞分离培养方法，为骨形成、骨代谢以及骨组织工程等基础研究提供种子细胞。 方法：实验于2002—09／2005-09在陕西省干细胞工程技术研究中心完成。①无菌条件下取五六个月龄流产胎儿颅盖骨（家属知情同意），去除骨膜及周围结缔组织，然后用2．5g/L胰蛋白酶消化20min，终止消化后，去除骨缝组织，剪碎，将碎骨块接种于培养瓶中分离培养成骨细胞。②细胞纯化采用差速贴壁法。通过相差显微镜观察人胚成骨细胞原代和传代培养的生长特征。③用碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色等方法对所获得的成骨细胞进行鉴定。 结果：①人胚成骨细胞原代和传代培养的生长特征：原代培养至第5天，骨块边缘出现零散的细胞，这些细胞的形态主要为梭形、三角形或多边形。原代培养第14天后，形成融合层，细胞呈圆形、卵圆形或方形紧密排列，叠层生长。传代细胞主要呈三角形或方形细胞，细胞排列无方向性，出现集落样生长趋势。②人胚成骨细胞的鉴定结果：90％以上分离获得细胞碱性磷酸酶染色和钙结节染色均呈阳性。 结论：采用酶消化后植块的改良植块培养法可在较短时间内获得大量成骨细胞，这些细胞具有典型的成骨细胞形态和功能，是一种较好的分离培养人胚成骨细胞的方法。     

兔脂肪间充质干细胞分离培养及其向神经细胞分化的特征

目的：分离培养兔脂肪间充质干细胞，探讨兔脂肪间充质干细胞在体外向神经细胞分化的能力。 方法：实验于2002-09／2005—09在陕西省干细胞工程技术研究中心完成。选取清洁级新西兰大白兔5只，采用1型胶原酶消化兔腹股沟皮下脂肪组织，分离培养脂肪间充质干细胞。取生长状况良好的第2，5，10代细胞，绘制生长曲线，计算细胞群体倍增时间。采用免疫组化方法对脂肪间充质干细胞表面分子标志[CD14，CD29，CD34，CD44．CD45，CD105及人白细胞抗原DR亚类（群）]进行鉴定，并采用1，2、5，5，10mmol／L不同浓度的β-巯基乙醇检测脂肪间充质干细胞向神经细胞分化的能力。 结果：①脂肪间充质干细胞生长曲线分析：第2，5．10代细胞体外传代培养的潜伏期约为24-48h，传代培养细胞的对数增殖期为6d，接种后第9天进入平台期。在细胞生长的对数期．脂肪间充质干细胞的倍增时间为64．12h。②脂肪间充质干细胞分子特征的鉴定结果：第2～5代细胞90％以上CD29，CD44，CD105呈阳性表达，而不表达CD14，CD34．CD45及人白细胞抗原DR亚类（群）等表面分子标记。③脂肪间充质干细胞向神经细胞分化情况：体外能够分化为神经细胞。 结论：兔脂肪组织可分离培养出脂肪间充质干细胞，并能够向神经细胞分化，有望成为组织工程的种子细胞来源。     

DiI在神经系统示踪研究方面的应用

1, 1'-双十八烷-3, 3, 3', 3'-四甲基吲哚羰花青-高氯酸盐(1, 1'-dioctadecyl-3, 3, 3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate, DiI),分子式为C59H97ClN2O4,分子量为933.88,是一种羰花青族荧光染料,为紫红色晶体,无毒,具有高度的亲脂性,在水中的溶解度极低,可溶于乙醇、甲醇,二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)和N,N-二甲基甲酰胺(N, N-dimethylformamide, DMF).