Meta分析双支架术与即兴支架术治疗冠状动脉真性分叉病变的临床疗效

目的系统评价双支架术与即兴支架术治疗冠状动脉真性分叉病变的临床疗效。方法计算机检索PubMed、Cochrane图书馆、Clinicaltrials.gov、中国知网和万方数据库,同时查阅心血管相关网站。检索时间为2000年1月至2018年1月,收集已公布随访数据的相关随机对照试验。根据Cochrane系统评价手册5.3评价文献质量并提取资料,运用RevMan 5.3软件进行荟萃分析。结果最终纳入11项研究,共包含2731例冠状动脉真性分叉病变患者(双支架术组1369例,即兴支架术组1362例)。相比于即兴支架术组,双支架术组显著降低了靶病变血运重建(RR=0.57,95%CI0.42~0.78,P=0.0003;I2=11%,P=0.34)及主要不良心血管事件(RR=0.71,95%CI0.58~0.86,P=0.0007;I2=43%,P=0.07)的风险。而两组患者发生死亡(RR=0.95,95%CI0.51~1.79,P=0.88;I2=43%,P=0.07)、心肌梗死(RR=0.94,95%CI0.70~1.28,P=0.32;I2=14%,P=0.70)及支架内血栓形成(RR=0.81,95%CI0.42~1.56,P=0.53;I2=0%,P=0.62)的风险比较,差异无统计学意义。结论相比于即兴支架术,双支架术治疗冠状动脉真性分叉病变显著降低了靶病变血运重建率。但仍需更长随访时间及更多高质量、大样本的随机对照研究进一步验证。     

人乳头瘤病毒16型 E5基因克隆、原核表达及产物鉴定

目的 克隆HPVl6 E5基因,构建原核重组工程菌并诱导表达,对表达产物HPVl6E5蛋白进行鉴定.方法 提取宫颈癌组织DNA作为模板,用PCR方法扩增HPVl6 E5基因,经BamH I和HindⅢ双酶切后,插入相同酶切的pET21b载体质粒,转化DH5α,筛选阳性克隆.经酶切和测序鉴定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),建屯重组工程菌株pET21b-HPVl6E5/BL21(DE3).经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物.结果 HPVl6 E5基因扩增片段0.27kb.测定序列与HPVl6原型株E5基因比较,出现4处核苷酸变异,分别为3979、4042、4077和4089位,引起144L和165V氨基酸改变.重组质粒经酶切和序列测定证实构建正确.SDS-PAGE分析重组菌在16 kDa处出现蛋白条带.该蛋白条带可被组氨酸标签单克隆抗体特异性识别.结论 成功克隆HPVl6E5基因,并构建原核表达质粒,E5 蛋白在BL21(DE3)中表达.本实验为进一步研究E5生物学活性、转化活性和肿瘤杀伤免疫作用奠定了实验基础.     

HPV16地方分离株E6基因的克隆与原核表达研究

目的克隆人乳头瘤病毒（HPV16E6）基因并在大肠埃希菌中表达，对表达产物进行鉴定。方法用PCR方法从克隆质粒pUC19-HPV16E6E7中扩增HPV16E6基因，采用定向克隆构建pQE30-HPV16E6原核表达质粒．利用酶切和序列测定鉴定重组质粒。将pQE30-HPV16E6转化大肠埃希菌BL21（DE3），建立重组工程菌pQE30-HPV16E6／BL21（DE3）。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，SDS—PAGE分析蛋白表达情况，利用Western blot鉴定抗原特异性。结果PCR产物470bp，重组质粒经酶切和序列测定证实构建正确。SDS—PAGE分析在18×10^3处有蛋白条带出现，与预期一致。Western blot分析证实目的条带与HPV16E6抗体有特异性反应。结论成功构建了HPV16E6基因的基因工程菌株，能高效表达E6蛋白，表达蛋白具有良好的免疫反应性。     

pET21b-HPV16E4重组质粒的构建及鉴定

目的 构建HPV16 E4重组表达质粒,以获得HPV16 E4活性蛋白,为进一步研究打基础.方法 从宫颈癌组织中提取DNA,用PCR方法扩增HPV16E4 DNA片段,定向克隆到原核表达载体pET21b质粒中,利用菌液PCR方法筛选重组阳性菌株.提取重组质粒,利用酶切图谱分析方法和核酸序列测定验证重组质粒pET21b-HPV16E4构建的正确性.结果 用PCR方法从宫颈癌组织中扩增出HPV16 E4片段,大小为0.3kb.从PCR筛选的重组菌株中提取重组质粒pET21b-HPV16E4,经单酶切得到5.7kb的片断,HindⅢ和BamHⅠ双酶切得到5.4kb和0.3kb两个片段,并且测序结果与已知序列相符,证实了重组质粒构建的正确性.结论 pET21b-HPV16E4重组质粒构建成功.     

重组人乳头瘤病毒16型E6蛋白的表达、纯化和动物免疫效果分析

目的 诱导表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)E6蛋白,制备可溶性蛋白,并通过动物免疫进行免疫效果评估.方法 采用IPTG诱导pQE30-HPV16E6/BL21(DE3)重组菌株,表达产物经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定.提取包涵体进行变性处理,变性蛋白经Ni2+金属螯合层析纯化,将纯化产物用复性透析方法处理以获取可溶性蛋白.免疫Bal B/c小鼠,检测血清抗体、CD4+/CD8+和IFN-γ.结果 诱导后重组菌有相对分子量18 000蛋白质表达,以不溶性包涵体为主要表达方式.目的蛋白可与HPV16E6多克隆抗体识别,纯化和透析处理后得到可溶性的蛋白.小鼠免疫后血清抗体滴度升高,淋巴细胞CD4+/CD8+升高,IFN-γ未见升高.结论 成功表达了HPV16E6蛋白,同时处理包涵体并制备了可溶性目的蛋白.目的蛋白可刺激小鼠体内产生有效的免疫反应,该蛋白的成功制备为患者血清抗体的检测和肿瘤细胞杀伤的免疫研究奠定了坚实基础.     

人乳头瘤病毒16型L1蛋白表达及其单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

目的表达并纯化重组人乳头瘤病毒16型（HPV16）L1蛋白，建立分泌抗HPV16 L1单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞株。方法以基因工程表达HPV16L1蛋白。用Ni—NTA技术进行纯化后免疫BALB／c小鼠，取脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，经含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶（HAT）的选择培养基及有限稀释法进行克隆化，用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，对获得的杂交瘤细胞株染色体进行计数．同时测定细胞培养上清mAb的效价。结果筛选出2株可分泌抗HPV16 L1 mAb的杂交瘤细胞，命名为AE3和AG7，染色体数分别为130条和98条。2株杂交瘤细胞AE3和AG7培养上清的效价分别为1：5120和1：80。结论成功建立了2株可分泌抗HPV 16 L1 mAb的杂交瘤细胞，为进一步研制HPV感染检测试剂盒提供实验基础。