禽流感重组禽痘病毒rFPV-HA-NA活载体疫苗的研究

目的：确定重组禽痘病毒rFPV-HA-NA疫苗株的最佳免疫剂量、免疫日龄、免疫产生时间及免疫持续期。方法：用重组禽痘病毒rFPV-HA-NA疫苗免疫SPF鸡，免疫后用HPAIVH5N1和H7N1AIV进行致死性攻击，观察疫苗免疫后的保护效果。结果：大约含100个PFU的重组病毒即能使机体获得对强毒攻击的100％保护；对1日龄SPF鸡进行免疫接种，4周后能100％抵抗HPAIV的致死性攻击；2周和3周龄的免疫鸡对免疫周1后的强毒攻击具有100％的保护力；重组病毒在免疫后10个月时，其诱导产生的血凝抑制（Haemagglutinin inhibition，HI）抗体仍保持在2-3log2水平，并可以提供100％抵抗病毒的致死性感染。结论：重组禽痘病毒rFPV-HA-NA疫苗是一种安全、高效的基因工程疫苗，它有望在不久的将来替代全病毒灭活疫苗用于高致病力禽流感的预防。     

密码子的鸡体偏嗜性优化增强H5亚型禽流感HA基因的表达水平和免疫原性

目的用鸡偏嗜性密码子替换H5亚型禽流感病毒A／Goose／GuangDong／1／96（H5N1）[GD／1／96（H5N1）]的保护性免疫原HA基因的密码子,优化和构建了基因optiHA5,以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。方法利用寡核苷酸合成、重叠延伸PCR法及限制酶切法构建了密码子优化的HA基因（optiA5）,并将其插入表达载体pCI构建了DNA疫苗质粒pCIoptiHA5;将pCIoptiHA5和表达GD／1／96（H5N1）HA基因的质粒pCIHA5通过问接免疫荧光法和Western—blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白;随之将pCIoptiHA5及pCIHA5分别以100μg和10μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡,4周后用100LD50的HPAIV GD／1／96（H5N1）鼻腔途径进行攻击。结果间接免疫荧光法和Western-blot分析表明基因optiHA5表达水平显著高于野生型HA基因;免疫SPF鸡后,100μg pCIoptiHA5可形成75％的免疫保护,100μg pCIHA5可形成50％的免疫保护;10μg pCIoptiHA5可形成对免疫鸡75％的部分免疫保护,而10μg pCIHA5则基本不能形成免疫保护;pCIoptiHA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。结论试验结果表明,HA基因密码子的优化可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平,提高免疫原性,增强免疫保护效果。