稳定表达α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体GluA1亚基单克隆细胞株的构建

目的 构建稳定表达α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体GluA1亚基的细胞株。 方法 PCR扩增GluA1目的基因,并将其装载至慢病毒表达载体PLV.0-绿色荧光蛋白（GFP）,采用4质粒系统转染HEK293T细胞包装慢病毒。嘌呤霉素抗性筛选细胞,挑选单克隆细胞株用Real-time PCR、Western blotting、免疫荧光和全细胞膜片钳鉴定GluA1的表达与功能。 结果 菌落PCR鉴定扩增产物与GluA1分子量（2724 bp）一致,经测序插入慢病毒载体序列与GluA1序列一致;慢病毒感染并抗性筛选的HEK293T细胞经Real-time PCR、Western blotting和免疫荧光实验证明,GluA1在过表达GluA1组的HEK293T细胞正确表达,空载体组不表达。单克隆挑选的稳定细胞株免疫荧光染色显示,各细胞膜表面GluA1蛋白表达相对一致。单克隆细胞在电压钳模式下,细胞外液加10 mmol/L谷氨酸诱导,空载体组检测不到电信号,而过表达GluA1组可记录5~40 pA电信号。 结论 成功构建了稳定表达AMPA受体GluA1亚基的HEK293T细胞株。