慢病毒介导绿色荧光蛋白转染人胚胎干细胞及其培养

目的 稳定培养人胚胎干细胞,并通过慢病毒载体对其进行绿色荧光蛋白标记.方法 利用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层或Matrigel作为基质培养人胚胎干细胞,包装带有GFP序列的慢病毒转染人胚胎干细胞.对转染前后的人胚胎干细胞进行了碱性磷酸酶和SSEA-3免疫组化鉴定.结果 在MEF饲养层和Matrigel上均可培养出呈克隆样生长,表达标志抗原的人胚胎干细胞,经慢病毒转染及抗生素筛选后仍可稳定表达GFP.结论 成功地培养了人胚胎干细胞系,并进行了GFP标记.     

食蟹猴胚胎干细胞的培养及向神经细胞诱导分化

目的 建立食蟹猴胚胎干细胞系体外培养体系,并诱导其向神经细胞分化,为在体移植实验奠定基础。方法 用小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层,长期培养食蟹猴胚胎干细胞。在无血清培养基中添加小鼠重组Noggin的方式诱导其向神经细胞分化,并对分化各阶段细胞进行免疫组化染色检测分化效果。结果 食蟹猴胚胎干细胞在滋养层上成克隆样生长,可以长期扩增超过20代并保持胚胎干细胞的特性。诱导向神经细胞分化约14d,即可形成呈玫瑰花环样的神经前体细胞结构,可见大量Nestin阳性细胞,及部分Tuj-1阳性细胞;分化约21d时,可见大量Nestin阳性细胞以及大量Tuj-1阳性细胞;分化超过35d,可见GFAP阳性细胞,而Tuj-1阳性细胞减少。结论 成功建立食蟹猴胚胎干细胞的培养体系,在此基础上诱导其分化可获得大量神经前体细胞,尤其是早期神经细胞。     

HtsA表达质粒克隆和蛋白质的纯化

目的克隆HtsA重组表达质粒以获得HtsA表达蛋白。方法通过PCR方法扩增获得A组链球菌HtsA基因完整的序列,将此片段定向克隆到表达载体pET21d质粒中,在E.coli BL21(DE3)中表达融合蛋白,并运用离子交换层析和疏水层析分离纯化HtsA蛋白。结果经琼脂糖电泳证实成功克隆了重组表达质粒pET21d-HtsA,pET21d-HtsA融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中得到表达,SDS-PAGE分析表明纯化的HtsA纯度较高。结论成功构建了A族链球菌HtsA基因重组表达质粒,并纯化获得了目的蛋白HtsA。     

胰酶和Ⅳ型胶原酶在人胚胎干细胞传代中的作用特点

目的对比人胚胎干细胞(hESC)培养过程中不同的酶消化细胞的特点,探讨适合hESC长期体外培养的消化传代方法。方法将正常生长在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)滋养层上的hESC分别用0.05%胰酶-EDTA和Ⅳ型胶原酶消化,重新接种,了解两种酶消化后的细胞存活率、克隆形成数量、细胞产量、冻存-复苏后细胞的存活率以及长期传代后细胞核型情况。结果用0.05%胰酶-EDTA消化传代后形成的克隆大小均一,每代第3d可获得碱性磷酸酶(AP)阳性克隆数(21.2±3.5)个/10倍视野,每次传代时hES细胞产量可达(4.56±1.29)×105/cm2,传代时细胞存活率高达95.60%,经冻存-复苏后也有81.20%细胞存活率。用Ⅳ型胶原酶消化组每代仅可获得低浓度胰酶消化组AP阳性克隆数的一半,克隆大小不均,细胞产量也比低浓度胰酶消化组少,传代时细胞存活率和复苏后细胞存活率和低浓度胰酶组相似。分别用两种酶处理传代十余代,核型均无异常。结论两种酶消化均适用于hESC培养,二者作用特点不完全相同,分别适用于不同的实验需要。     

利用巢式聚合酶链反应检测单个胚胎小体细胞中时钟基因的表达

目的建立一组灵敏的检测时钟基因(c lock gene)的巢式聚合酶链反应(nested PCR)方法,并检测小鼠胚胎小体(EB)来源的单细胞中重要时钟基因的表达情况。方法培养小鼠胚胎干细胞(mESC),体外诱导分化为EB,提取总RNA并进行反转录,用BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因特异引物进行巢式聚合酶链反应,电泳检测扩增产物,从而建立相应的巢式PCR反应体系。利用膜片钳获取胚胎小体来源的单个细胞,通过巢式PCR反应检测相应时钟基因的表达情况。结果确定了BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2基因的扩增参数。证明在此条件下无非特异扩增,并且能够检测到至少两个拷贝的目的分子。利用此检测体系发现,部分胚胎小体细胞中BMAL1、CLOCK、CRY1和CRY2时钟基因环路不完整。结论巢式PCR方法能够灵敏地、而且特异地从单细胞中检测出一组时钟基因的表达,时钟基因的转录在胚胎小体细胞中并不一致,即时钟基因的环路不完整。时钟基因可能在细胞分化过程中发挥着某种作用。     

不同滋养层对维持人胚胎干细胞的生长作用

目的 比较不同滋养层对保持连续传代培养的人胚胎干细胞(hESC)不分化和高增殖能力作用的差异.方法 分别用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)、人包皮成纤维细胞(hFF)、人骨髓间充质细胞(hMSC)作为滋养层培养hESC系H9细胞,采用碱性磷酸酶染色和台盼蓝染色观察不同滋养层支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量和细胞存活率,并采用免疫荧光染色对传代5代以后的hESC进行生物学鉴定.结果 3种滋养层细胞均可维持hESC呈克隆样生长,但是不同滋养层支持的克隆的形态差异大.3种滋养层细胞支持的hESC的大鼠抗阶段特异性胚胎抗原-3及碱性磷酸酶染色均呈阳性.MEF支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量和细胞存活率均显著高于人来源滋养层(均P<0.01).hMSC支持的hESC的碱性磷酸酶阳性克隆数、细胞产量均显著高于hFF的hESC(均P<0.01).结论 3种滋养层细胞均可支持hESC的正常生长.MEF最有利于hESC的增殖,但是两种人来源滋养层细胞为去除动物源性的hESC培养体系奠定了基础.在维持hESC增殖方面,hMSC优于hFF.