HCV NS3 N末端部分氨基酸缺失对NS3/NS3与NS3/NS4A分子间相互作用的影响

目的旨在弄清ＮＳ３参与分子间相互作用的确切区段，为研究针对ＮＳ３的抗ＨＣＶ寡肽小分子药物的设计提供依据。方法参照ＨＣＶ中国河北株序列设计ＮＳ３引物，将其Ｎ末端的前１５个和前３０个氨基酸分别缺失掉。然后用酵母双杂交系统检测ＮＳ３／ＮＳ３及ＮＳ３／ＮＳ４Ａ分子间相互作用强度在缺失前后的变化，从而判明ＮＳ３Ｎ末端氨基酸在分子间相互作用中的意义。核苷酸序列分析采用ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ３７３Ａ型自动测序仪。结果ＮＳ３Ｎ末端氨基酸缺失前后，ＮＳ３／ＮＳ３分子间及ＮＳ３／ＮＳ４Ａ分子间相互作用的强度相差有显著性（Ｐ＜０．０１），但缺失１５个氨基酸和缺失３０个氨基酸对上述相互作用强度的影响差异无显著性（Ｐ＞０．０５）。结论ＮＳ３Ｎ末端的１～３０个氨基酸在ＮＳ３／ＮＳ３及ＮＳ３／ＮＳ４Ａ分子间相互作用中有一定意义，其Ｎ末端前１５个氨基酸（ＡＰＩＴＡＹＳＱＱＴＲＧＬＬＧ）对于分子间相互作用更为关键。本研究结果将为抗ＮＳ３丝氨酸蛋白酶活性的寡肽抑制物的研究打下基础，并为抗ＨＣＶ的寡肽小分子药物的设计提供依据     

破坏泛素依赖的蛋白水解通路对p53转录激活的抑制作用

目的 :研究功能性泛素化及蛋白酶体水解过程对p5 3转录激活的影响。方法 :通过瞬时转染报告基因法 ,测定内源、外源性p5 3或p5 3转录活性片断的转录能力 (荧光素酶活性 ) ;Western blot法测定细胞内p5 3及其靶蛋白p2 1waf1 的表达水平。结果 :抑制蛋白酶体水解过程 ,细胞内源、外源性p5 3及p5 3转录活性片断的转录能力均降低 ;泛素化途径缺失时 ,p5 3转录能力被显著抑制 ,虽然细胞内p5 3蛋白堆积 ,但其下游靶蛋白p2 1waf1 的表达却无增加。结论 :p5 3泛素蛋白酶体水解途径与其转录激活过程存在功能性联系     

泛素化缺失细胞系中p53和Vp-16转录活性的研究

目的探讨转录因子p53和Vp16在泛素化缺失细胞系ts85细胞中转录活性的变化规律。方法采用瞬时转染报告基因测定法,检测ts85细胞裂解液荧光素酶活性(代表p53或Vp16转录因子的转录活性);采用Westernblot法测定细胞内p53、p21和Vp16的稳态蛋白水平。结果ts85细胞泛素激活酶失活,p53调节的转录活性明显降低,DNA损伤时亦得到类似结果;人工合成的转录因子Vp16的转录活性在功能性泛素化破坏时也显著减低。结论功能性泛素化过程对p53和Vp16调节的转录及功能调节具有直接的重要作用。     

人胃癌差异表达基因片段的分离与测序

目的:肿瘤差异表达基因在肿瘤的发生发展中起重要作用,胃癌在我国全部恶性肿瘤死亡构成比中居第一位,本文拟钓取人胃癌差异表达基因片段,探讨胃癌发生发展的机制.方法:应用最新分离差异基因的mRNA差异显示技术,优化反应条件对人胃癌组织中差异表达的基因片段进行分离,测序和Northem验证.结果:获得经Northem杂交证实的在胃癌组织中表达的两个cDNA片段scg1和scg2,序列分析表明长度分别为194bp和343bp,同源性比较结果显示scg1和scg2与GenBank中已发表基因序列均无同源性.结论:本研究初步证实scg1和scg2可能是人胃癌组织中表达的新基因片段,推测与人胃癌发生发展相关.检测全长cDNA序列的深入工作正在进行中.     

中国人α1型干扰素基因新变种的cDNA序列测定及其表达

为了逐步阐明中国人ＩＦＮ－α基因结构与功能的特点,将从一中国汉族正常胎儿肝细胞染色体ＤＮＡ中获得的一组ＰＣＲ克隆产物（ＰＣＲＡ０１、ＰＣＲＡ０２）分别进行核苷酸序列测定,结果表明,以上两次ＰＣＲ产物序列完全相同,它们与过去分离的ＩＦＮ－α１和ＩＦＮ－αＤ基因之间的氨基酸序列差异小于１％,为ＩＦＮ－α１基因的不同变种。     

在翻译水平上提高人干扰素α1基因的原核表达

目的　根据翻译起始调控的定量理论及利用翻译增强子序列 ,提高人干扰素α1型变种IFN α1C基因的原核表达。方法　采用“步移式”聚合酶链反应 (PCR) ,对IFN α1C基因 5′端核苷酸序列进行三种不同程度的碱基突变 ,使IFN α1C在pBV2 2 0载体中形成的翻译起始区域 (TIR)的二级结构自由能 (△G)逐渐降低 ,同时 ,采用PCR技术 ,将翻译增强子cDNA序列引入pBV2 2 0中的SD序列上游 ,构建一种新型载体pBVE。结果　三种IFN α1C改造基因的表达量均有所提高 ,而且随△G从原有的 - 5 0 2 4 1.6J mol降至 - 2 2 190 .0J mol(绝对值 ,下同 ) ,其表达量有逐渐升高趋势 ,最高可达 2 .4 3×10 8U L ,约为IFN α1C母体的 13倍。选用IFN α1C及其三种改造基因为报导基因 ,结果显示以pBVE为载体的抗病毒活性比在pBV2 2 0中增强了 2～ 5倍。结论　含有翻译增强子的pBVE为一种新型原核高效表达载体。翻译调控的定量关系理论 ,可有效地运用于提高IFN α1C基因在大肠埃希菌中的表达。     

丙型肝炎病毒NS3丝氨酸蛋白酶基因的克隆和表达

丙型肝炎病毒ＮＳ３丝氨酸蛋白酶基因的克隆和表达邓小艺朱千政杨佩英军事医学科学院微生物学流行病学研究所北京１００８５０丙型肝炎病毒（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ，ＨＣＶ）是输血后非甲非乙肝炎的主要病原体，约有４０％～５０％的丙型肝炎病人可发展成为慢性...     

泛素化缺失细胞系中p53和Vp-16转录活性的研究

目的：探讨转录因子p53和Vp-16在泛素化缺失细胞系ts85细胞申转录活性的变化规律。方法：采用瞬时转染报告基因测定法．检测ts85细胞裂解液荧光素酶活性(代表p53或Vp-16转录因子的转录活性)：采用Western blot法测定细胞内p53、p21和Vp-16的稳态蛋白水平。结果：ts85细胞泛素激活酶失活，p53调节的转录活性明显降低，DNA损伤时亦得到类似结果：人工合成的转录因子Vp-16的转录活性在功能性泛素化破坏时也显著减低。结论：功能性泛素化过程对p53和Vp-16调节的转录及功能调节具有直接的重要作用。     

中国人α1型干扰素基因新变种的cDNA序列测定及其表达

为了逐步阐明中国人ＩＦＮ－α基因结构与功能的特点,将从一中国汉族正常胎儿肝细胞染色体ＤＮＡ中获得的一组ＰＣＲ克隆产物（ＰＣＲＡ０１、ＰＣＲＡ０２）分别进行核苷酸序列测定。结果表明,以上两次ＰＣＲ产物序列完全相同,它们与过去分离的ＩＦＮ－α１和ＩＦＮ－αＤ基因之间的氨基酸序列差异小于１％,为ＩＦＮ－α１基因的不同变种。ＰＣＲＡ０１、ＰＣＲＡ０２开放读码框架完全相同,与ＩＦＮ－α１和ＩＦＮ－αＤ基因相比较,其第２９９位为Ｔ,与其相应编码的第１００位氨基酸为Ｖａｌ。该基因为继黎孟枫等１９９１年所分离的ＩＦＮ－α１Ｃ基因之后所发现的又一中国人α１型干扰素基因新变种——ＩＦＮ－α１／１００Ｖ,建议命名为ＩＦＮ－α１ｄ基因。将该基因克隆于原核表达载体ＰＢＶ２２０,测定其抗病毒活性为２．４×１０７Ｕ／Ｌ。为进一步研究ＩＦＮ－α１亚型的生物学特性和其在基因进化上的关系奠定了基础     

破坏泛素依赖的蛋白水解通路对p53转录激活的抑制作用

目的：研究功能性泛素化及蛋白酶体水解过程对p53转录激活的影响。方法：通过瞬时转染报告基因法，测定内源、外源性p53或p53转录活性片断的转录能力(荧光素酶活性)；Western—blot法测定细胞内p53及其靶蛋白p21^wafl的表达水平。结果：抑制蛋白酶体水解过程，细胞内源、外源性p53及p53转录活性片断的转录能力均降低；泛素化途径缺失时，p53转录能力被显著抑制，虽然细胞内p53蛋白堆积，但其下游靶蛋白p21^wafl的表达却无增加。结论：p53泛素蛋白酶体水解途径与其转录激活过程存在功能性联系。