携带钙整合素结合蛋白基因逆转录病毒表达载体的构建及包装细胞系的建立

目的:构建钙整合素结合蛋白(CIB)的逆转录病毒表达载体,并建立包装细胞系.方法:质粒pet32-CIB经EcoR I和Xho I双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体pLXSN,构建重组逆转录病毒表达载体pLXSN-CIB,PCR及双酶切鉴定后,通过脂质体转染导入包装细胞pA317,G418稳定筛选后获得抗性克隆,NIH3T3细胞进行逆转录病毒颗粒谪度测定.结果:重组逆转录病毒表达载体pLXSN-CIB质粒测序结果与GenBank中序列一致,经PCR及酶切鉴定证实,获得了大约574 bp的基因片段,且正确插入pLXSN-CIB载体中；建立了pA317-CIB包装细胞系,采用NIH3T3细胞测定病毒滴度为6.81 ×105 CFU/mL.结论:pLXSN-CIB结构正确,成功构建了CIB基因的逆转录病毒表达载体并建立了pLXSN-CIB包装细胞系.     

抗ricin中和性单抗4C13单链抗体的真核表达及生物活性检测

目的:实现基于中和性单抗4C13单链抗体的真核表达,并对其生物学活性进行评价.方法:用TRIzol提取抗ricin中和性单抗杂交瘤细胞4C13总RNA,扩增其轻、重链可变区基因,登陆GenBank;用Linker(GGGGS)3将VH和VL连接,用重叠延伸PCR克隆入真核表达载体pCDNA 3.1,用脂质体转染293T细胞,对瞬时表达产物进行生物学活性检测.结果:中和性单抗杂交瘤细胞4C13轻、重链可变区基因在GenBank中的登录号为DQ389248和DQ389245,ScFv与ricin可特异性结合,培养上清原液和2倍稀释液的抑制率分别为33.7%和29%;ScFv在ricin浓度为0.01～0.005 ng/mL时可中和ricin 对SP2/0细胞的细胞毒,随着ricin浓度逐渐增大,细胞存活率逐渐减低.结论:研究结果为研制基于中和性单抗的其他ricin拮抗剂奠定了重要的理论和实践基础.