乙型肝炎病毒核心抗原在疫苗研究中的应用

乙型肝炎病毒核心抗原(hepatitis B virus core antigen,HBcAg)是乙型肝炎病毒的核衣壳蛋白,具有高度的免疫原性,能自我装配形成病毒样颗粒,并可接受外源基因的插入.HBcAg作为载体和佐剂已用于数十种病原微生物抗原表位的表达和新型疫苗的研发.此文就HBcAg的结构特点、免疫原性及其在疫苗研究中的应用进展作一综述.     

硫氰钴铵比色法检测流感裂解疫苗中Triton N-101残留量

目的 用硫氰钴铵比色法检测流感裂解疫苗中Triton N- 101残留量.方法 用硫氰钴铵显色,620nm测定吸光度,检测Triton N - 101的线性、空白回收率、加标回收率和精密度.结果 Triton N - 101含量在0～400μg/ml时,线性良好,R2大于0.99;空白回收率在87.4％～ 95.4％之间,加标回收率在94.7％～ 99.8％之间；精密度(CV％)≤6％.结论 该方法能满足流感裂解疫苗中Triton N - 101残留量检测.     

乙型肝炎病毒核心抗原在大肠杆菌中的构建及表达

目的用基因工程的方法获得乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)编码区的基因片段,构建重组质粒并在大肠杆菌中表达抗原蛋白。方法用PCR法扩增HBcAg基因片段,构建含有HBcAg基因的克隆质粒及表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)plys中以IPTG诱导重组蛋白的表达,并用Western blot对重组蛋白进行检测。结果重组HBcAg在大肠杆菌中得到表达,Western blot检测显示在预期位置出现特异性条带。结论成功构建HBcAg原核表达系统并获得重组HBcAg,为该重组蛋白的相关功能研究奠定了基础。     

重组毕赤酵母HBsAg诱导小鼠细胞免疫应答的研究

目的   研究毕赤酵母表达的重组HBsAg(Pichia-rHBsAg)在小鼠中诱导T细胞免疫应答的能力,评价疫苗的免疫原性.   方法  以rHBsAg免疫雌性BALB/c小鼠,制备小鼠脾淋巴细胞,并在体外以抗原/特异性多肽刺激.采用ELISA法测定抗原特异性T淋巴细胞分泌的细胞因子,酶联免疫斑点法(ELISPOT)测定CTL频数.   结果 由毕赤酵母表达的rHBsAg可在小鼠中诱导Th1和Th2型免疫应答;加铝佐剂的rHBsAg诱导IFN-γ的水平及CTL克隆明显高于无佐剂抗原;Pichia-rHBsAg刺激小鼠细胞免疫应答的水平强于酵母-rHBsAg,与中国仓鼠卵巢细胞-rHBsAg相仿.   结论   Pichia-rHBsAg可在BALB/c小鼠中诱导较强的细胞免疫应答.     

含前S表位重组HBsAg联合重组HBcAg的免疫原性研究

 目的  研究含前S表位重组HBsAg（SS1S2）与重组HBcAg（C）联合免疫BALB/c小鼠的体液和细胞免疫应答。 方法   用纯化的SS1S2与C分别配制含或不含Al(OH)3佐剂（Al）的疫苗。采用简单随机法将雌性BALB/c小鼠分为5组：阴性对照（NC）、SS1S2、SS1S2+C、SS1S2+Al、SS1S2+C+Al,各组分别于0和21 d进行腹腔免疫,对照组注射磷酸盐缓冲液。初免及加强后1周各取一半小鼠采血,采用ELISA法测定抗-HBs、抗-前S1、抗-前S2和抗-HBc滴度;常规制备脾淋巴细胞,用酶联免疫斑点法测定分泌IFN-γ的T细胞频数。采用t检验对各组结果进行比较。 结果   联合HBcAg的疫苗组均产生了较高水平的抗-HBs、抗-前S1、抗-前S2和抗-HBc。初免后1周,SS1S2+C组的抗-HBs阳转比例（1/5）高于SS1S2组（0/5）、SS1S2+Al+C组（4/5）高于SS1S2+Al组（3/5）;SS1S2+C组的抗-前S1阳转比例（3/5）高于SS1S2组（0/5）;HBcAg对抗-前S2的产生无影响。加强免疫后,各疫苗组的抗体滴度均升高,联合HBcAg的疫苗组各抗体滴度明显高于SS1S2疫苗组。各组疫苗免疫后均可诱导细胞免疫应答,初免后SS1S2+C和SS1S2+Al+C组分泌IFN-γ的T细胞频数显著超过SS1S2和S1S2+Al组（t值分别为2.926、2.974,P值均<0.05）;加强免疫后,各组均有加强效应,SS1S2+C组的T细胞频数明显超过SS1S2组（t=4.604,P=0.010）。 结论   SS1S2联合HBcAg可在BALB/c小鼠中诱导较强的免疫应答,HBcAg可增强SS1S2诱导的体液及细胞免疫应答。     

改良的基因重排16型人乳头瘤病毒E7DNA候选疫苗诱导野生型E7特异性T细胞应答

高危人乳头瘤病毒（hr-HPV）感染是宫颈癌（cc）发生的主要原因，约50％的cc由HPV—16所致。hr—HPVE7致癌基因编码的蛋白具有转化活性，并在HPV感染细胞中持续表达，可以作为特异的靶抗原用于cc及恶性前发育异常的免疫治疗。为去除HPV-16E7的致癌活性，德国OEhlschlaeger等将野生型E7基因（E7WT）中与转化活性相关的三个位点切开，得到的4个片段重排后形成核心部分，尾部加入原片段间三个连接处的核苷酸序列以保留所有潜在CTL表位，头部加入Kozak序列以增强免疫原性，获得了改良的重排HPV-16E7基因（HPV—16E7SH），同时构建了pTHamp—E7SH重组质粒，并以pTHamp—E7WT和空质粒作对照进行了研究。     

C端截短的乙型肝炎病毒核心抗原的原核表达及免疫原性

 目的   原核表达C端截短的乙型肝炎病毒核心抗原（hepatitis B virus core antigen,HBcAg）〔HBcAg(aa 1-149）〕,并研究其在小鼠中的免疫原性。方法   用聚合酶链反应扩增C端截去34个氨基酸的HBcAg基因片段,构建含HBcAg（aa 1-149）基因的克隆质粒及表达质粒,在大肠杆菌Rossatta2中以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组蛋白的表达。表达产物经Ni²⁺亲和层析柱纯化后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、蛋白质印迹法鉴定。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,用ELISA法检测血清抗-HBc水平。结果   重组原核表达质粒pET15b HBcAg(aa 1-149)经双酶切和SDS-PAGE鉴定证明构建正确。重组HBcAg（aa 1-149）在大肠杆菌中获得高效表达,表达形式主要为可溶性蛋白。蛋白质印迹法显示在预期位置（相对分子质量约17 000位置）出现特异性条带。纯化后的重组蛋白纯度较高（＞90%）,并可在小鼠中诱生较高水平的抗-HBc。结论   重组HBcAg（aa 1-149）在原核系统中获得成功表达,并可在小鼠中诱导抗体应答。