毕氏酵母KM71和GS115发酵工艺的比较

目的：探讨毕氏酵母菌KM71和GS115表达人可溶性FLt3配体,CD40L－IL－13,IL－11及TNFα等外源蛋白的发酵工艺,方法：挑取KM71或GS115单个菌落在BMGY培养基中初步培养,在其A600值达2－6时,转入发酵罐中行高密度发酵,结果：KM71诱导表达时,以甲的需求较低,故添加甲醇速度应较慢,并应提高菌的接种浓度;而S115菌株生长速度较快,代谢甲醇的能力较强,表达量相对较高。结论：KM71和GS115可用于不同性质外源蛋白的表达,表达量较高,是一种理想的表达系统。αα     

大肠杆菌表达重组人IL-8分离纯化工艺的建立

目的　建立重组人IL - 8(rhIL - 8)大肠杆菌表达后的高效分离纯化工艺 ,以便获得高纯度的重组蛋白。方法　将已构建好的表达载体转化大肠杆菌HB10 1,经IPTG诱导进行高效表达。将离心收集到的菌体用超声破壁分离 ,收集包涵体和胞浆 ,其中包涵体部分经变性和复性处理后 ,与胞浆部分合并 ,进行肝素亲和层析柱分离 ,再经离子交换柱和凝胶层析柱过滤 ,得到最终纯品。蛋白纯度用SDS -PAGE鉴定 ,ELISA法检测重组IL - 8含量。检测纯化后重组蛋白的生物学活性和热源质。结果　用大肠杆菌HB10 1表达重组人IL - 8,具有较高的表达量 (2 5mg/ml) ,其分泌的重组蛋白以包涵体和胞浆的形式存在。经多步柱层析纯化后 ,可获得高纯度的重组IL- 8蛋白 (纯度 >95 % )。该蛋白在体外具有趋化中性粒细胞游走的作用 ,兔温法检测热源质含量符合要求。结论　大肠杆菌可高效表达rhIL - 8,该工艺流程可从大肠杆菌载体中获得具有生物学活性的高纯度rhIL - 8。     

建立线粒体DNA中A3243G突变检测方法

目的建立正常人血线粒体DNA中A3243G突变的检测方法。方法采集正常人血液标本,抽提DNA,设计两对启动-关闭引物,采用聚合酶链反应(PCR)扩增mtDNA的高变区I(HVI)3221-3524bp片段。结果正常人血DNA中检出A3243G突变。结论该方法可在正常人血DNA中检出A3243G突变,可作为一种临床检测方法用于人群早期检查。     

毕氏酵母KM71和GS115发酵工艺的比较

目的探讨毕氏酵母菌KM71和GS115表达人可溶性FLt3配体、CD40L、IL-13、IL-11及TNFα等外源蛋白的发酵工艺.方法挑取KM71或GS115单个菌落在BMGY培养基中初步培养,在其A600值达2～6时,转入发酵罐中行高密度发酵.结果KM71诱导表达时,对甲醇的需求较低,故添加甲醇速度应较慢,并应提高菌的接种浓度;而GS115菌株生长速度较快,代谢甲醇的能力较强,表达量相对较高.结论KM71和GS115可用于不同性质外源蛋白的表达,表达量较高,是一种理想的表达系统.     

可溶性gp130酶联检测试剂盒的研制及其运用

目的 :建立灵敏、特异、稳定和简便的人可溶性gp130 (sgp130 )酶标检测试剂盒。方法 :采用本室制备的鼠抗人gp130单抗T2作为包被单抗 ,另一株识别不同抗原位点的单抗T12经生物素 (biotin)标记后作为检测抗体 ,建立双单抗夹心的人sgp130酶标检测方法 ,并分别测定了 40例健康供血员、40例甲亢及 47例慢性肾炎患者血清中sgp130的含量。结果 :成功地研制了人sgp130酶联检测试剂盒 ,其灵敏度为 10ng/ml。该试剂盒 4℃放置 3个月 ,离散度 (CV) <± 7 6 %,回收率为95 %～ 111%,提示检测方法具有良好的灵敏度、稳定性和准确性。用该试剂盒测得的血清中sgp130含量的 95 %正常值范围为5 36 92～ 2 87 88(ng/ml) ,甲亢及慢性肾炎患者血清中sgp130的含量分别为 937 16± 2 17 5 9和 80 6 4 5± 138 4 7(ng/ml) ,明显高于正常对照者 (P <0 0 1)。结论 :建立的人sgp130酶标检测试剂盒 ,能够对血清中sgp130进行准确定量 ,可为临床gp130相关性疾病的辅助诊断、疗效估价和判断预后提供有价值的生物学参数 ,具有良好的运用前景。     

内皮抑制素抑制TNFα和IL-8介导的血管内皮细胞增殖及其表面粘附分子的表达

目的：探讨重组人内皮抑制素对 ＴＮＦα和ＩＬ－８介导的人血管内皮细胞株（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｏｆ ｖｅｓｓｅｌｓ,ＥＣＶ）细胞增殖的抑制作用,并观察内皮抑制素对ＥＣＶ表面粘附分子表达的影响。方法：用ＭＴＴ法测定ＥＣＶ的增殖;用间接免疫荧光法,在流式细胞仪上测定 ＥＣＶ表面粘附分子的表达。结果：内皮抑制素浓度在 １００～１００００ ｎｇ／ｍｌ时,能显著抑制ＥＣＶ的增殖（Ｐ＜０．０１）,并抑制ＩＬ－８和ＴＮＦα介导的ＥＣＶ增殖,且呈剂量依赖性关系。内皮抑制素在 １００～１０００ ｎｇ／ｍｌ时可抑制内皮细胞表面ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ４０等粘附分子的表达。结论：内皮抑制素不但可抑制血管内皮细胞的增殖,控制肿瘤新生血管的形成,而且可抑制血管内皮细胞表面粘附分子的表达,对肿瘤的转移亦可能起抑制作用。     

4-1BBL在人高转移性肺癌细胞株95D的表达及其生物学作用

目的 探讨共刺激分子4-1BBL在人高转移性肺癌细胞株95D细胞的表达并在体外分析4-1BBL逆向信号对95D细胞的功能影响.方法 采用免疫荧光和流式细胞术及RT-PCR检测4-1BBL分子在95D细胞中的表达,进而在体外采用可溶性4-1BB-Ig融合蛋白激发4-1BBL逆向信号,分析95D表达膜型负性免疫调节分子CD95L、PD-LI和B7-H3的变化.结果 95D细胞表达4-1BBL,4-1BB激发的逆向信号可上调95D细胞表达膜型CD95L、PD-LI和B7-H3.结论 体外研究结果提示共刺激分子4-1BBL表达于肿瘤细胞,4-1BBL逆向信号可能通过上调表达肿瘤细胞表而的负性免疫分子,参与肿瘤细胞的免疫逃逸机制.     

重组人IL-8在大肠杆菌中的表达及纯化工艺的优化

目的优化重组人IL-8（rhIL-8）大肠杆菌表达及纯化工艺，以便获得高纯度的重组蛋白。方法将已构建好的表达载体转化大肠杆菌HB101，经3-吲哚丙烯酸诱导，在发酵罐中进行表达，比较不同诱导剂浓度、温度、pH值及时间，以获得最佳表达工艺参数。离心收集菌体，超声破壁，收集包涵体和胞浆，其中包涵体经变性、复性处理，与包浆部分合并，经肝素亲和层析柱、阳离子交换柱和凝胶层析柱分离纯化，比较不同的洗脱条件，得到纯品，并对重组蛋白的纯度和生物学活性进行鉴定。结果用大肠杆菌HB101在发酵罐中表达rhIL-8，在30℃、pH为7．0的条件下加入50mmol／L 3-吲哚丙烯酸，诱导28h，得到约为100mg／ml的高表达，其分泌的重组蛋白以包涵体和胞浆的形式存在，经三步层析纯化后，得到高纯度的rhIL-8（纯度〉95％），经中性粒细胞趋化实验证实，所获IL-8具有良好的趋化白细胞迁移的作用。结论建立高效表达rhIL-8的原核表达和纯化工艺，所获的纯化IL-8具有良好的生物学活性。