诱导分化过程中不同融合状态大鼠骨髓间充质干细胞成骨的差异

背景:诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的方案已基本成熟,但是诱导过程中影响分化效果的因素仍处于探索阶段.目的:观察诱导时机的选择对大鼠骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的影响.设计、时间及地点:以细胞为对象的观察实验,于2006-08/2007-01在苏州大学江苏省干细胞重点实验室完成,省级重点实验室完成.材料:骨髓间充质干细胞来源于SD大鼠,雌雄不限,体质量150～200 g.方法:采用Percoll淋巴细胞分离液分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.将第3代大鼠骨髓间充质干细胞以5×107 L-1密度分组培养,诱导组分别于接种当时、细胞达50%～60%融合时、细胞达85%～95%融合时加入含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的成骨诱导培养基诱导.非诱导组采用普通培养基培养.主要观察指标:诱导后7,14 ,21,28 d行钙钴染色、Von-Kossa染色、碱性磷酸酶活性检测成骨细胞能力.定期在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化及生长状况.结果:经钙钴染色后,诱导组大部分染色的细胞呈阳性反应,胞浆中可见浅棕色至棕黑色的细胞颗粒,大多数多角形细胞呈阳性,如铺路卵石样排列,随着时间的延长,可见片状强阳性细胞,以细胞达85%～95%融合时诱导培养组数量最多,结节体积最大.非诱导组未见片状强阳性细胞.Von-Kossa 染色后可见深棕色致密结节.以细胞达85%～95%融合时诱导培养组形成结节较早,同期相比数量较其他组多.细胞内碱性磷酸酶活性检测表明经成骨诱导剂诱导后与同期非诱导组相比细胞内碱性磷酸酶活性明显提高,表现细胞成骨分化特点.结论:初始接种密度相同的情况下,细胞间相互接触程度越高,成骨能力越强.     

小鼠胚胎干细胞与复合丝素膜的生物相容性研究

探索胚胎干细胞与丝素材料结合的可行性及生物相容性,建立一套在丝素膜上小鼠胚胎干细胞的体外培养体系.通过形态观察、MTT比色法、克隆形成率分析、碱性磷酸酶检测、免疫荧光染色、核型分析等方法,研究丝素膜对小鼠胚胎干细胞的黏附、生长情况、未分化状态的维持、胚胎干细胞特性、遗传、分化等方面的影响.结果显示,两者之间具有良好的生物相容性,丝素膜材料支持小鼠胚胎干细胞的体外无限扩增和未分化特征,并保持其正常核型.证实丝素材料可作为胚胎干细胞结合的良好生物材料.     

神经元在丝素蛋白材料上的生长发育

目的研究神经元在丝素蛋白材料上的生长发育,为神经干细胞结合丝素蛋白材料用于临床移植修复神经系统损伤提供实验依据。方法从新生大鼠脑室下区（SVZ）分离细胞,培养在柞蚕、家蚕两种丝素蛋白溶液制成的薄膜材料上,分别选取各时间段的细胞进行β-Ⅲ-tubulin特异性免疫荧光染色,并统计不同时间段神经元在丝素材料上的成活率及复杂度。结果神经元在柞蚕丝素薄膜上的成活率和复杂度明显比家蚕丝素薄膜高,差异均有统计学意义（均P〈0.05）。结论柞蚕、家蚕丝素薄膜支持神经元的生长,具有良好的生物相容性;柞蚕丝素薄膜比家蚕丝素薄膜更适合神经元的生长。     

再生柞蚕丝素蛋白对人骨髓间充质干细胞体外扩增的支持作用

大量的研究表明家蚕丝素蛋白具有良好的生物相容性。而对于柞蚕丝素蛋白在医用生物领域的研究报道在国内外尚较少。本研究选择再生柞蚕丝素蛋白为研究对象，观察了人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）在再生柞蚕丝素膜上的粘附、生长及表面抗原的变化。结果在1h观察再生柞蚕丝素对hBMSCs的粘附力几乎与胶原相同，明显优于家蚕丝素和聚苯乙烯培养板。MTT法检测结果显示在第4d hBMSCs在再生柞蚕丝素膜上的增殖明显高于其他各组。电镜观察结果显示hBMSCs在再生柞蚕丝素膜上能够很好的粘附、生长，细胞间能相互连接形成片状结构。流式细胞仪检测再生柞蚕丝素蛋白对hBMSCs表面抗原的表达亦无明显影响。本研究结果显示再生柞蚕丝素蛋白体外支持hBMSCs的粘附、生长，具有良好的细胞相容性。     

大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞诱导分化及神经蛋白的动态表达

背景:现阶段骨髓间充质干细胞定向诱导分化为神经元样细胞的方法并不统一.目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞体外向神经样细胞诱导分化的条件,及其定向分化过程中神经蛋白的动态表达.设计、时间及地点:细胞形态学观察及蛋白分子水平检测,于2006-09/2007-01在苏州大学生命科学学院完成.材料:清洁级SD大鼠2只.胎牛血清为杭州四季青产品,成纤维生长因子、丁羟基茴香醚为Sigma公司产品,二甲基亚砜为Amresco产品. 方法:Percoll法体外分离培养、扩增纯化大鼠骨髓间充质干细胞,调整细胞密度为5×107 L-1.设立2组,诱导组用含10%胎牛血清和10 μg/L成纤维生长因子的L-DMEM培养基预诱导24 h后,再以含2%二甲基亚砜和200 μmol/L丁羟基茴香醚的L-DMEM无血清培养基诱导1,3,5 h.对照组始终用含10%胎牛血清的L-DMEM进行培养.主要观察指标:细胞形态学变化,免疫荧光染色鉴定神经细胞表型.结果:预诱导24 h,胞体由原来的长梭形变成多角形或不规则形,伸出多个短棒状突起,可见2～3个核仁,细胞间漩涡状生长趋势消失,排列无规律;诱导1～3 h,细胞逐渐变圆,胞质收缩明显,折光性增强,双级或多极的突起互相连接呈网状;诱导5 h,突起出现一、二级分支.诱导1 h后部分细胞表达神经前体细胞表面抗原巢蛋白;3 h后巢蛋白达高峰,同时表达成熟神经元标志物神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白;5 h后巢蛋白表达下降,神经元特异性烯醇化酶和微管蛋白达高峰.对照组细胞形态无明显变化,巢蛋白表达为阴性.结论:在添加化学诱导剂之前先使用成纤维生长因子进行预诱导,能促进骨髓间充质干细胞向神经前体细胞和神经元转化,且在诱导分化过程中神经蛋白分子的表达顺序与神经细胞发育过程一致.     

着丝粒蛋白B在基因组未复制的有丝分裂期细胞中的表达

着丝粒蛋白Ｂ（ＣＥＮＰ－Ｂ）主要位于染色体着丝粒区域的中心域，是一种ＤＮＡ结合蛋白，与染色体着丝粒、动粒的结构形成与功能实施有关。本研究结果显示咖啡因可以诱导ＣＨＬ细胞发生ＭＵＧ细胞。利用核酸杂交技术证明了在ＣＨＬ细胞中存在ＣＥＮＰ－Ｂ基因，并研究了咖啡因诱导ＭＵＧ细胞形成过程中ＣＥＮＰ－Ｂ的基因表达。发现ＣＥＮＰ－Ｂ在ＭＵＧ细胞整个过程中均有表达，表现出表达持续性。这与我们在Ｈｅｌａ细胞中发现的     

大鼠大脑皮层细胞条件培养液促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的研究

目的建立大脑皮层细胞条件培养液促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的方法。方法原代培养并鉴定骨髓间充质干细胞;用条件培养基、无血清培养基、DMEM分别诱导骨髓间充质干细胞6h和24h;用免疫荧光染色的方法鉴定由骨髓间充质干细胞分化而来的神经样细胞。结果骨髓间充质干细胞表达CD106、CD90、CD29和CD44标记物,不表达CD71、CD45和CD34,回收得到的条件培养基可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞,这些神经样细胞的免疫荧光染色呈β微管蛋白Ⅲ、胶质原纤维酸性蛋白、巢蛋白阳性,且阳性比例明显高于实验对照组,差异有高度统计学意义（P〈0.001）。结论大脑皮层细胞条件培养液能促进骨髓间充质干细胞向神经样细胞的分化。     

Rac1蛋白表达与神经前体细胞增殖分化的关系

目的探讨Rac1蛋白表达与神经前体细胞增殖分化的关系。方法取新生大鼠大脑皮层,原代培养获得混合细胞培养体系,在含10%血清的培养基中培养6 d细胞汇合后更换无血清培养基继续培养。实验中设计4个时间点,用倒置相差显微镜观察细胞增殖分化的变化,免疫荧光染色技术鉴定细胞种类以及Rac1蛋白在细胞内的表达,通过Western blot检测Rac1蛋白的表达变化。结果建立了新生SD大鼠大脑皮层原代混合细胞培养体系,此体系底层主要是由Ⅰ型胶质细胞组成的单层细胞,GFAP染色呈阳性;在单层细胞上面有一些小圆形强折光性神经前体细胞生长,βⅢ-Tubulin染色呈阳性。更换无血清培养基后上层神经前体细胞大量增殖,βⅢ-Tubulin、Rac1染色呈阳性。Western blot定量分析结果显示,神经前体细胞增殖过程中Rac1蛋白表达上升,而分化过程中Rac1蛋白的表达下降。结论Rac1蛋白表达与神经前体细胞的增殖分化过程密切相关,可能参与了神经前体细胞的增殖分化过程。     

基质细胞衍生因子-1α对间充质干细胞迁移的影响

［摘要］目的: 研究基质细胞衍生因子-1α（stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α）对间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）迁移的影响及可能的机制。方法: 采用全骨髓法体外分离培养并扩增大鼠骨髓来源的MSCs,应用Boyden 趋化小室实验观察不同质量浓度（0,5,25,50和100 ng/mL）的SDF 1α对MSCs定向迁移的影响,通过蛋白质印迹法和Boyden趋化小室实验观察细胞内PI3K/Akt和MAPKs信号通路在MSCs向SDF-1α迁移过程中的变化。结果： 不同质量浓度的SDF-1α通过调节PI3K/Akt和MAPKs信号通路,不同程度上影响MSCs的趋化性迁移,低质量浓度的SDF-1α促进细胞迁移,而高质量浓度对细胞迁移起到抑制作用;阻断MSCs中基底水平PI3K/Akt和MAPKs信号通路在不同程度上抑制了MSCs趋向SDF-1α迁移作用。结论：MSCs向SDF 1α迁移能力随着PI3K/Akt信号的强弱而增减;JNK/SAPK信号的减弱显著抑制了SDF-1α诱导的MSCs定向迁移;SDF-1α可以促进细胞内ERK1/2和p38MAPK两条信号通路,而ERK1/2和p38MAPK信号对SDF-1α促进的细胞迁移影响并不显著。     

血小板衍生生长因子对骨髓间充质干细胞向成神经细胞分化趋化性迁移的影响

目的初步探讨血小板衍生生长因子（PDGF）对成神经细胞分化不同阶段骨髓间充质干细胞（BMSCs）趋化性迁移的影响。方法密度梯度离心和贴壁培养法分离培养BMSCs,并予以传代。用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和丁羟基茴香醚（BHA）相结合的方法诱导BMSCs向成神经细胞分化,并用特异性标志物进行鉴定,利用Dunn chamber建立体外迁移模型,评估PDGF对不同分化阶段BMSCs定向迁移的影响。结果通过密度梯度离心和贴壁培养法获得了纯化的大鼠BMSCs。诱导组BMSCs变为神经元样细胞,而对照组的BMSCs形态无变化。Dunn chamber分析显示,分化不同阶段的BMSCs对PDGF的趋化程度不同：和对照组相比较,未诱导的BMSCs、预诱导24h和诱导5h的分化细胞的迁移速率得到明显提高（P〈0.05）;而未诱导的BMSCs、维持18h和维持48h的分化细胞的迁移效率明显升高（P〈0.05）。结论 BMSCs可以被诱导分化为神经样细胞;分化不同时期的细胞有不同的迁移能力。