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目的 研究肠道病毒71型(EV71)3CD蛋白在致病机制中的作用。方法 实验分为对照组、SDLY1组、SDLY107组和SDLY107(1-3CD)组。通过反向遗传技术将弱毒株SDLY1株的3CD蛋白编码区置换到强毒株SDLY107株,形成拯救病毒SDLY107(1-3CD)株。将EV71病毒接种于RD细胞和Vero细胞,于37℃和39.5℃孵育一定时间后,采用MTT试验检测活细胞量,以判断病毒对细胞损伤作用的改变。结果 37℃下,拯救病毒SDLY107(1-3CD)对细胞的损伤作用弱于SDLY107株,但仍强于SDLY1株(P<0.05);39.5℃下,拯救病毒SDLY107(1-3CD)株对细胞的损伤作用较SDLY107株下降(P<0.05),但与SDLY1株的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 EV713CD编码区的置换可以改变病毒对细胞的损伤作用,3CD蛋白编码区可能存在影响病毒毒力的位点。这一发现有助于理解EV71的致病机制。 相似文献
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目的评价重组嵌合表达人偏肺病毒(hMPV)表位的流感病毒的免疫应答及免疫保护效果。方法用8质粒系统拯救出的在NS基因中嵌合hMPV表位的重组流感病毒免疫BALB/c小鼠,检测其刺激机体产生的针对hMPV和流感病毒的抗体滴度,及脾细胞分泌细胞因子含量。免疫后小鼠用hMPV和流感病毒进行攻击,对攻击后小鼠肺组织和鼻甲骨中病毒含量采用数字PCR方法进行测定,同时对肺组织进行HE染色,评价其对肺部损伤的保护作用。结果重组流感病毒株rFLU/hMPV/B(嵌入了hMPV的B细胞表位)免疫小鼠后,产生了针对hMPV和流感病毒的特异性抗体。rFLU/hMPV/CTL+Th(嵌入了CTL表位/Th细胞表位)免疫小鼠后,产生了针对流感病毒的特异性抗体及hMPV特异的细胞毒性T淋巴细胞反应(IFN-γ分泌增多)。rFLU/hMPV/B和rFLU/hMPV/CTL+Th引起了平衡的Th1/Th2免疫应答。用hMPV和流感病毒攻击重组病毒免疫后小鼠,肺组织病理HE染色结果显示重组病毒免疫后小鼠肺病变明显减轻,肺组织和鼻甲骨中hMPV和流感病毒含量也明显减少。结论重组的2株嵌合有hMPV B细胞表位和CTL表位/Th细胞表位的重组流感病毒株,可刺激机体产生针对hMPV和/或流感病毒体液免疫应答,嵌合有hMPV CTL表位/Th细胞表位的重组流感病毒株还可刺激机体产生hMPV特异性的细胞免疫应答,对hMPV和流感病毒攻击也有一定保护作用,该重组病毒株有潜在疫苗应用价值。 相似文献
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目的 对天津流行的人A组轮状病毒VP7、VP4和NSP4基因进行分型和序列特征分析。方法 收集2018—2020年天津市急性腹泻A组轮状病毒(Rotavirus group A, RVA)阳性病例的粪便标本,提取核酸,进行RT-PCR扩增VP7、VP4和NSP4基因片段全长并进行测序和进化树分析。结果 本次研究所有RVA均属于G9P[8]基因型,进化树分析其VP7和VP4基因分别属于G9-VI和P[8]-3亚型。分析NSP4基因片段发现19株为E1型,12株为E2型。TJ株VP7、VP4、NSP4与疫苗株和参考株比对发现在关键位点有氨基酸替代现象。31个TJ-VP7氨基酸序列与 Rotavac G9 和Rotasiil G9 VP7相比,各有4个和3个替换位点。31例天津株VP8*核苷酸序列与Rotarix P[8]-1和RotaTeq相比,各有6个和3个氨基酸差异。天津株VP5*核苷酸与两种疫苗相比,仅在RotaTeq的5-1区I388L这一处发现氨基酸位点变异情况,其余11个氨基酸位点高度保守;而与Rotarix5-1到5-5区氨基酸序列完全一致。TJ E1株与疫苗株的NSP4序列相比在ASI和ASII区分别有2和3个氨基酸位点发生变异;TJ E2株与疫苗株的NSP4序列相比在ASI-ASIV分别有3、8、2和5个氨基酸位点发生替换。2018—2020年在天津地区检测到19株G9P[8]-E1型RVA,12株G9P[8]-E2型RVA,这是首次在天津发现G9P[8]-E2重组基因型。结论 与同基因型疫苗株和参考株相比,位于TJ株VP7、VP4和NSP4抗原位点的改变对于疫苗保护效力的影响还需进一步研究。需要对轮状病毒分子变异和重组现象进行持续监测,不只是单一监测G/P分型情况,要考虑多基因片段共同分析和全基因组测序,以便及时追踪和掌握轮状病毒的重组和变异情况。 相似文献
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目的 利用反向遗传技术分别对肠道病毒71型(EV71)强毒株SDLY107和弱毒株SDLY1的3C和3CD编码区进行置换,拯救重组病毒。方法 使用PCR技术得到重组片段3C(1)-3D-3'UTR(107)和3CD(1)-3'UTR(107),并克隆入pMD19-T。利用双酶切、T4连接酶将两种重组3CD-3'UTR分别置换入本室构建并保存的EV71的SDLY107株的感染性cDNA克隆pMD19-T-107,得到重组pMD19-T-107后,将其线性化并转染入横纹肌肉瘤(RD)细胞,盲传得到重组病毒107(1-3C)和107(1-3CD)。对收获病毒进行鉴定。结果 构建了重组EV71全长cDNA克隆;RNA转染并盲传至第3代,36 h后RD细胞出现细胞病变(CPE),48 h出现明显的CPE,成功拯救重组病毒SDLY107(1-3C)和SDLY107(1-3CD);重组病毒产生的CPE更接近SDLY107。结论 成功构建了重组EV71反向遗传系统,拯救了重组病毒SDLY107(1-3C)和SDLY107(1-3CD),为进一步研究3C与3D蛋白在EV71致病机制中的作用提供基础。 相似文献
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目的在Vero细胞、RD细胞和U87细胞3种细胞系中,研究EV71的2A蛋白对宿主细胞增殖能力的影响及对细胞的损伤作用,揭示2A蛋白在EV71的致病机制中所起的作用。方法将野毒株EV71SDLY 107株(强毒株)、EV71SDLY 1株(弱毒株)和嵌合毒株EV71SDLY 107-2A-1感染Vero细胞、RD细胞、U87细胞后,利用MTT试验测定3种细胞在感染病毒后不同时间点的存活情况,绘制细胞生长曲线,比较细胞增殖程度,并利用单因素方差分析法分析3种细胞在感染不同病毒48h后的存活率;结果 EV71SDLY 107株感染Vero细胞和RD细胞后细胞增殖程度和存活率均低于EV71SDLY 1株(t=41.64,P0.001;t=33.28,P0.001);EV71SDLY 107-2A-1嵌合株感染Vero细胞和RD细胞后,细胞增殖程度和存活率均高于亲本病毒EV71SDLY 107株,低于EV71SDLY 1株(t=17.97,P0.001;t=42.09,P0.01);EV71SDLY 107-2A-1株感染U87细胞后细胞存活率低于EV71SDLY 1株(t=8.85,P0.001),但与EV71SDLY 107株感染后细胞存活率无统计学差异(t=0.74,P=0.603);不同细胞感染同株病毒48h后,U87细胞存活率均为最低,Vero细胞存活率均为最高。结论 EV71强毒株的2A蛋白对细胞产生的损伤作用大于弱毒株的2A蛋白,提示2A蛋白在EV71对宿主细胞的作用中发挥功能。 相似文献
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目的 构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系,研究微复制子的复制及表达情况。方法 聚合酶链式反应扩增绿色荧光蛋白(EGFP),利用特定酶切位点及连接酶,将目的基因片段连接至pMD19-T载体,分别构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系。荧光显微镜下观察微复制子表达情况,实时荧光定量PCR观察微复制子复制情况。结果 EV71非结构蛋白微复制子及EV71 3C蛋白酶微复制子表达后,均可观察到特异性绿色荧光,荧光强度有明显差异;转染后12~72 h取样所测RNA含量几乎不变。结论 非结构蛋白全长及3C蛋白酶启动微复制子转录强度不同,所构建微复制子不具备复制功能,提示结构蛋白编码区对病毒RNA复制有重要意义。 相似文献
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