肠道病毒71型3CD蛋白对细胞的损伤作用

目的 研究肠道病毒71型(EV71)3CD蛋白在致病机制中的作用。方法 实验分为对照组、SDLY1组、SDLY107组和SDLY107(1-3CD)组。通过反向遗传技术将弱毒株SDLY1株的3CD蛋白编码区置换到强毒株SDLY107株,形成拯救病毒SDLY107(1-3CD)株。将EV71病毒接种于RD细胞和Vero细胞,于37℃和39.5℃孵育一定时间后,采用MTT试验检测活细胞量,以判断病毒对细胞损伤作用的改变。结果 37℃下,拯救病毒SDLY107(1-3CD)对细胞的损伤作用弱于SDLY107株,但仍强于SDLY1株(P<0.05);39.5℃下,拯救病毒SDLY107(1-3CD)株对细胞的损伤作用较SDLY107株下降(P<0.05),但与SDLY1株的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 EV713CD编码区的置换可以改变病毒对细胞的损伤作用,3CD蛋白编码区可能存在影响病毒毒力的位点。这一发现有助于理解EV71的致病机制。     

2020年天津市宁河区急性胃肠炎聚集疫情病原体轮状病毒全基因组序列分析

目的 分析2020年天津市宁河区一起急性胃肠炎聚集疫情的病原A组轮状病毒(RVA)的全基因组序列,调查原因及防控措施.方法 对送检轮状病毒阳性粪便标本核酸进行提取,经real-time PCR进一步确证;构建DNA测序文库,采用二代测序法进行测序,合格序列拼接为11条基因片段.对轮状病毒重要VP7、VP4和NSP4等序...     

嵌合人偏肺病毒(hMPV)表位的重组流感病毒免疫保护效果

目的评价重组嵌合表达人偏肺病毒(hMPV)表位的流感病毒的免疫应答及免疫保护效果。方法用8质粒系统拯救出的在NS基因中嵌合hMPV表位的重组流感病毒免疫BALB/c小鼠,检测其刺激机体产生的针对hMPV和流感病毒的抗体滴度,及脾细胞分泌细胞因子含量。免疫后小鼠用hMPV和流感病毒进行攻击,对攻击后小鼠肺组织和鼻甲骨中病毒含量采用数字PCR方法进行测定,同时对肺组织进行HE染色,评价其对肺部损伤的保护作用。结果重组流感病毒株rFLU/hMPV/B(嵌入了hMPV的B细胞表位)免疫小鼠后,产生了针对hMPV和流感病毒的特异性抗体。rFLU/hMPV/CTL+Th(嵌入了CTL表位/Th细胞表位)免疫小鼠后,产生了针对流感病毒的特异性抗体及hMPV特异的细胞毒性T淋巴细胞反应(IFN-γ分泌增多)。rFLU/hMPV/B和rFLU/hMPV/CTL+Th引起了平衡的Th1/Th2免疫应答。用hMPV和流感病毒攻击重组病毒免疫后小鼠,肺组织病理HE染色结果显示重组病毒免疫后小鼠肺病变明显减轻,肺组织和鼻甲骨中hMPV和流感病毒含量也明显减少。结论重组的2株嵌合有hMPV B细胞表位和CTL表位/Th细胞表位的重组流感病毒株,可刺激机体产生针对hMPV和/或流感病毒体液免疫应答,嵌合有hMPV CTL表位/Th细胞表位的重组流感病毒株还可刺激机体产生hMPV特异性的细胞免疫应答,对hMPV和流感病毒攻击也有一定保护作用,该重组病毒株有潜在疫苗应用价值。     

天津市2018—2020年人轮状病毒株VP7、VP4和NSP4基因特征

目的 对天津流行的人A组轮状病毒VP7、VP4和NSP4基因进行分型和序列特征分析。方法 收集2018—2020年天津市急性腹泻A组轮状病毒（Rotavirus group A, RVA）阳性病例的粪便标本,提取核酸,进行RT-PCR扩增VP7、VP4和NSP4基因片段全长并进行测序和进化树分析。结果 本次研究所有RVA均属于G9P[8]基因型,进化树分析其VP7和VP4基因分别属于G9-VI和P[8]-3亚型。分析NSP4基因片段发现19株为E1型,12株为E2型。TJ株VP7、VP4、NSP4与疫苗株和参考株比对发现在关键位点有氨基酸替代现象。31个TJ-VP7氨基酸序列与 Rotavac G9 和Rotasiil G9 VP7相比,各有4个和3个替换位点。31例天津株VP8*核苷酸序列与Rotarix P[8]-1和RotaTeq相比,各有6个和3个氨基酸差异。天津株VP5*核苷酸与两种疫苗相比,仅在RotaTeq的5-1区I388L这一处发现氨基酸位点变异情况,其余11个氨基酸位点高度保守;而与Rotarix5-1到5-5区氨基酸序列完全一致。TJ E1株与疫苗株的NSP4序列相比在ASI和ASII区分别有2和3个氨基酸位点发生变异;TJ E2株与疫苗株的NSP4序列相比在ASI-ASIV分别有3、8、2和5个氨基酸位点发生替换。2018—2020年在天津地区检测到19株G9P[8]-E1型RVA,12株G9P[8]-E2型RVA,这是首次在天津发现G9P[8]-E2重组基因型。结论 与同基因型疫苗株和参考株相比,位于TJ株VP7、VP4和NSP4抗原位点的改变对于疫苗保护效力的影响还需进一步研究。需要对轮状病毒分子变异和重组现象进行持续监测,不只是单一监测G/P分型情况,要考虑多基因片段共同分析和全基因组测序,以便及时追踪和掌握轮状病毒的重组和变异情况。     

2019年天津市急性胃肠炎人群诺如病毒基因分型分析

目的分析2019年天津市急性胃肠炎人群中诺如病毒的基因特征。方法本研究采集2019年全年天津市各区疾病预防控制中心送检的散发、暴发、聚集性腹泻诺如病毒阳性粪便标本，采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法将标本进行扩增，对阳性产物进行聚合酶区和衣壳区序列测定，构建系统进化树。结果诺如病毒总体阳性率为6.01%（97/1615），除1月无样本检测外，其他各月份均有诺如病毒的检出。 其中GⅠ组检出率1.11%（18/1615），GⅡ组检出率5.02%（81/1615）。 聚合酶区和衣壳区基因分型结果:2019年的基因型别为GⅡ.2［P16］、GⅡ.4［P31］、GⅡ.17［P17］、GⅠ.3［P13］、GⅡ.6［P7］、GⅠ.5［P4］、GⅡ.3［P12］、GⅠ.5［P12］、GⅠ.1［P1］、GⅠ.2［P2］等。 13起急性胃肠炎暴发或聚集性腹泻病例中占比前3位的基因重组株为GⅡ.2［P16］（30.77%，4/13）、GⅡ.4［P31］（23.08%，3/13）、GⅡ.17［P17］（23.08%，3/13）。结论天津市诺如病毒感染的基因型呈多样性，不同基因型持续共同进化和循环，需进一步加强诺如病毒病原监测及分子分型鉴定工作。     

天津滨海新区本土疫情新型冠状病毒全基因组测序和溯源分析

目的:对引起天津滨海新区本土新型冠状病毒肺炎(COVID-19,简称新冠肺炎)疫情的新型冠状病毒(SARS-CoV-2,简称新冠病毒)进行全基因组溯源及变异情况分析。方法:对2020年11月7日至12月5日采集的天津滨海新区新冠肺炎疫情1例本地无症状感染者和5例确诊病例咽拭子样本进行全基因组高通量测序,De novo拼...     

重组肠道病毒71型反向遗传系统构建

目的 利用反向遗传技术分别对肠道病毒71型（EV71）强毒株SDLY107和弱毒株SDLY1的3C和3CD编码区进行置换,拯救重组病毒。方法 使用PCR技术得到重组片段3C（1）-3D-3'UTR（107）和3CD（1）-3'UTR（107）,并克隆入pMD19-T。利用双酶切、T4连接酶将两种重组3CD-3'UTR分别置换入本室构建并保存的EV71的SDLY107株的感染性cDNA克隆pMD19-T-107,得到重组pMD19-T-107后,将其线性化并转染入横纹肌肉瘤（RD）细胞,盲传得到重组病毒107（1-3C）和107（1-3CD）。对收获病毒进行鉴定。结果 构建了重组EV71全长cDNA克隆;RNA转染并盲传至第3代,36 h后RD细胞出现细胞病变（CPE）,48 h出现明显的CPE,成功拯救重组病毒SDLY107（1-3C）和SDLY107（1-3CD）;重组病毒产生的CPE更接近SDLY107。结论 成功构建了重组EV71反向遗传系统,拯救了重组病毒SDLY107（1-3C）和SDLY107（1-3CD）,为进一步研究3C与3D蛋白在EV71致病机制中的作用提供基础。     

MTT试验检测EV71 2A蛋白对宿主细胞损伤作用

目的在Vero细胞、RD细胞和U87细胞3种细胞系中,研究EV71的2A蛋白对宿主细胞增殖能力的影响及对细胞的损伤作用,揭示2A蛋白在EV71的致病机制中所起的作用。方法将野毒株EV71SDLY 107株(强毒株)、EV71SDLY 1株(弱毒株)和嵌合毒株EV71SDLY 107-2A-1感染Vero细胞、RD细胞、U87细胞后,利用MTT试验测定3种细胞在感染病毒后不同时间点的存活情况,绘制细胞生长曲线,比较细胞增殖程度,并利用单因素方差分析法分析3种细胞在感染不同病毒48h后的存活率;结果 EV71SDLY 107株感染Vero细胞和RD细胞后细胞增殖程度和存活率均低于EV71SDLY 1株(t=41.64,P0.001;t=33.28,P0.001);EV71SDLY 107-2A-1嵌合株感染Vero细胞和RD细胞后,细胞增殖程度和存活率均高于亲本病毒EV71SDLY 107株,低于EV71SDLY 1株(t=17.97,P0.001;t=42.09,P0.01);EV71SDLY 107-2A-1株感染U87细胞后细胞存活率低于EV71SDLY 1株(t=8.85,P0.001),但与EV71SDLY 107株感染后细胞存活率无统计学差异(t=0.74,P=0.603);不同细胞感染同株病毒48h后,U87细胞存活率均为最低,Vero细胞存活率均为最高。结论 EV71强毒株的2A蛋白对细胞产生的损伤作用大于弱毒株的2A蛋白,提示2A蛋白在EV71对宿主细胞的作用中发挥功能。     

肠道病毒71型微复制子的构建

目的 构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系,研究微复制子的复制及表达情况。方法 聚合酶链式反应扩增绿色荧光蛋白(EGFP),利用特定酶切位点及连接酶,将目的基因片段连接至pMD19-T载体,分别构建EV71非结构蛋白及EV71 3C蛋白酶微复制子体系。荧光显微镜下观察微复制子表达情况,实时荧光定量PCR观察微复制子复制情况。结果 EV71非结构蛋白微复制子及EV71 3C蛋白酶微复制子表达后,均可观察到特异性绿色荧光,荧光强度有明显差异;转染后12~72 h取样所测RNA含量几乎不变。结论 非结构蛋白全长及3C蛋白酶启动微复制子转录强度不同,所构建微复制子不具备复制功能,提示结构蛋白编码区对病毒RNA复制有重要意义。