SFTSV重组假病毒的构建及Gc糖基化对病毒感染力的影响

目的为探究发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)中Gc及其N-糖基化位点与病毒感染性的关系, 构建了含有SFTSV Gc糖基化位点突变体的重组假病毒。方法利用定点突变和同源重组技术构建了SFTSV Gc及3个N-糖基化位点突变的真核表达载体pcDNA3.1(+)-Gc、pcDNA3.1(+)-Gc(N291Q)、pcDNA3.1(+)-Gc(N352Q)和pcDNA3.1(+)-Gc(N374Q)。验证其在293T细胞中成功表达后, 感染VSVΔG-Fluc*G假病毒, 构建4株重组假病毒并检测其对细胞感染力的影响。结果双酶切鉴定和序列测定证实成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Gc、pcDNA3.1(+)-Gc(N291Q)、pcDNA3.1(+)-Gc(N352Q)和pcDNA3.1(+)-Gc(N374Q)。间接免疫荧光和Western blot结果表明4个重组质粒均成功表达。SFTSV Gc重组假病毒对Vero细胞有感染特异性。糖基化位点突变后假病毒感染能力明显降低, 且352位糖基化位点突变株感染水平最低(P<0.001、P=0.001)。结论 SFTSV G...     

SFTSV Gn关键氨基酸突变对细胞自噬与病毒增殖的影响

目的 探究发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)中Gn蛋白关键氨基酸突变(I323V)对细胞活性以及病毒复制的影响,并通过检测自噬相关蛋白水平推测其可能机制。方法 利用定点突变和同源重组技术构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)。验证其在BSR-T7/5细胞中成功表达后,检测SFTSV Gn对细胞活性、病毒复制和细胞自噬的影响。结果 双酶切鉴定和序列测定证实成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-Gn和pcDNA3.1(+)-Gn(I323V)。间接免疫荧光和Western Blot结果表明Gn和Gn(I323V)成功表达。过表达Gn对病毒复制无明显影响,但表达Gn(I323V)后病毒增殖速率明显降低;Gn和Gn(I323V)的表达可不同程度降低细胞存活率(P<0.05),并引起细胞内自噬相关蛋白LC3 Ⅱ和p62表达增多(P<0.05)。结论 SFTSV Gn可能是通过抑制自噬流从而影响细胞活性,且第323位氨基酸突变对宿主细胞和病毒复制有明显影响。